Введение
Развитие и жизнеспособность многоклеточных происходят путем сложных взаимодействий молекул и клеток, во-влеченных в пролиферацию, миграцию, дифференциацию, функционирование и апоптоз. Эти взаимодействия строго регулируются. Каждая клетка организма должна постоянно обмениваться информацией с окружающей средой и реагировать на нее, а также на изменения, происходящие в ней. В клетке существует несколько сигнальных путей, таких как Fgf, Hedgehog, Wnt, TGFß, Notch и др. [1, 2], которые циклично включаются или выключаются. Регуляторный эффект сигнальных каскадов достигается путем активации факторов транскрипции, образующих ген-регуляторные сети, в рамках которых они взаимодействуют друг с другом и регулируют экспрессию генов, расположенных ниже по иерархии, а также экспрессию собственных генов [3]. Основополагающую роль в этих сетях выполняет группа генов, кодирующих мастер-регуляторы, играющие ключевую роль в определении судьбы клеток при развитии организма [4]. Несмотря на некоторые разногласия в определении данного термина, в целом мастер-ген можно охарактеризовать как ген, который экспрессируется в начале развития определенного типа клеток, участвует в их дальнейшей специализации и при аномальной экспрессии может привести к перепрограммированию клеток в другой тип [5]. Пристальный интерес к мастер-генам вызван еще и тем, что при внутриклеточных процессах, происходящих при эмбриогенезе, регенерации поврежденных органов и опухолеобразовании используются одни и те же мастер-регуляторы [4, 6]. Так, в процессе опухолеобразования активируются эмбриональные сигнальные каскады и ген-регуляторные сети, приводящие к трансдифференциации и пролиферации клеток, поддержанию отдельной популяции раковых клеток в стволовом состоянии, появлению у ряда эпителиальных клеток мезенхимальных свойств, способствующих их инвазии и распространению по организму (эпителиально-мезенхимальный переход) [7, 8]. Мастер-гены, отвечающие за перечисленные выше процессы, в перспективе могут рассматриваться как маркеры при диагностике рака и как мишени направленной противоопухолевой терапии.
К таким генам-регуляторам относится ген транскрипционного фактора SOX9, играющий критическую роль в процессах эмбриогенеза на многих стадиях. Будучи важным фактором развития и поддержания гомеостаза клеток поджелудочной железы, он рассматривается многими авторами как мастер-регулятор панкреатической программы [9]. В частности, он играет важную роль в процессе канцерогенеза поджелудочной железы (ПЖ). В этом обзоре мы рассмотрим его участие в эмбриогенезе ПЖ и ее злокачественном перерождении.
Свойства белка SOX9 и его гена
Белки группы SOX относятся к семейству белков, содержащих так называемый высококонсервативный ДНК-связывающий домен с высокой подвижностью HMG (High Mobility Group). Геном млекопитающих содержит примерно 20 генов, кодирующих представителей этого семейства, которые разделены на группы A-H на основании сходства аминокислотной последовательности домена HMG и структурной гомологии аминокислотной последовательности вне домена HMG [10]. Sox9 входит в группу E. ДНК-связывающий домен HMG, расположенный на N-конце, состоит из трех альфа-спиралей, которые связываются с малой бороздкой ДНК, вызывая ее расширение и сгибание ДНК в сторону большой бороздки (рис. 1)
Помимо домена HMG, белок содержит трансактивационный домен на С-конце (см. рис. 1) [12—14]. Он отвечает за взаимодействие SOX9 как с универсальными активаторами транскрипции, такими как CREB-binding protein (CBP)/p300 [16], так и тканеспецифичными [17, 18]. SOX9 может проявлять свою активность в качестве мономера [19], а также образовывать гомодимеры [20] или гетеродимеры с другими белками группы E [21] посредством димеризационного домена (см. рис. 1) [21].
Домен HMG связывает ДНК с низкой аффинностью, и этого связывания обычно недостаточно для передачи активирующего/репрессирующего сигнала, даже несмотря на наличие активационного домена. SOX9 проявляет свою активность через привлечение белков-партнеров, совместно с которыми он образует активирующий или репрессирующий транскрипционный комплекс на регуляторной последовательности, несущей сайты узнавания SOX9 и его партнера [22]. Это свойство SOX9 (как и ряда других членов группы SOX) позволяет ему включаться в разные клеточные программы в зависимости от того, с каким партнером он взаимодействует, при этом в ходе развития возможен обмен партнерами [12, 13].
Свойства белка SOX9 также могут модулироваться пост-трансляционными модификациями, такими как фосфорилирование, убиквитинилирование и сумоилирование (см. рис. 1) [12]. Например, фосфорилирование сериновых остатков (S64 и S211) усиливает его ДНК-связывающую способность и повышает транскрипционную активность в отношении целевых генов [23], сумоилирование остатков лизина, напротив, подавляет ее [24].
Экспрессия гена SOX9 контролируется протяженными областями, расположенными в пределах 1 млн п.о. вверх от гена и 1,5 млн п.о. вниз от гена и содержащими универсальные и тканеспецифичные энхансерные элементы [25]. В первой области расположен энхансер, отвечающий за авторегуляцию экспрессии гена Sox9 [26]. In silico-анализ показал наличие в промоторной области гена SOX9 сайтов связывания ERBB2, TFII-B, AP-1, NF-B, белков семейств NKX, POU, CREB, KLF, SMAD и других факторов, связанных с канцерогенезом и поддержанием клеток в стволовом состоянии [27].
Таким образом, регуляторная область гена SOX9 и особенности структуры продукта его экспрессии делают его активным элементом ген-регуляторных сетей.
SOX9 — мастер-регулятор развития ПЖ
ПЖ состоит из двух морфологически различных отделов — экзокринного и эндокринного. Эндокринная часть, отвечающая за уровень сахара в крови, организована в островки Лангерганса, которые состоят из клеток 5 типов — α, β, δ, ε и PP, секретирующих глюкагон, инсулин, соматостатин, грелин и панкреатический полипетид соответственно. Основную массу железы представляет экзокринная часть, состоящая из ацинарных клеток, продуцирующих пищеварительные ферменты, и клеток, выстилающих выводящие протоки. Нарушения в функционировании эндокринных β-клеток могут приводить к развитию сахарного диабета, повреждения экзокринной части вызывают панкреатит и рак ПЖ.
Стадии развития основных типов клеток ПЖ
Основные стадии развития клеток ПЖ представлены на рис. 2.
SOX9 и другие факторы развития ПЖ
SOX9 является одним из мастер-регуляторов развития ПЖ [9, 31]. Выключение экспрессии гена Sox9 у клеток-предшественников ПЖ ведет к ее гипоплазии [32]. Гаплонедостаточность по SOX9 вызывает кампомелическую дисплазию, характеризующуюся также и недоразвитием ацинарной и эндокринной частей ПЖ, что указывает на существенную роль SOX9 в развитии данных типов клеток [33]. Помимо Sox9, в развитии ПЖ принимает участие ряд транскрипционных факторов, таких как Pdx1, Ptf1a, FoxA2, Hnf1β (Tcf2), Hnf6 (Onecut), Nkx6.1, Hes1, Ngn3 и др., которые являются активными звеньями ген-регуляторной сети панкреатической программы. Одни из ветвей сети запускаются на этапах формирования клеток-предшественников, другие — в ходе дифференцировки в основные типы клеток П.Ж. На данный момент установлены партнеры Sox9, коэкспрессирующиеся с ним на определенных стадиях развития ПЖ (см. таблицу).
Инициация развития ПЖ
Sox9 детектируется уже на стадии индукции развития ПЖ в соответствующем участке кишечной трубки [34]. Примерно в это же время обнаруживаются факторы FoxA2, Pdx1, Hnf1β, Hnf6 [34—36] и несколько позднее Ptf1a [37]. Между их генами устанавливается сложное взаимодействие от кооперации до регуляции экспрессии друг друга (рис. 3, а).
FoxA2 считается пионерским фактором, отвечающим за открытие хроматина регуляторных областей генов [38—40]. Его сайты связывания расположены в регуляторной области гена Pdx1, за счет чего происходит активация последнего [36]. Данное взаимодействие между этими генами сохраняется вплоть до созревания β-клеток [41]. Активация Pdx1 также может происходить по пути Hnf1β-Hnf6-Pdx1 [35]. В экспериментах in vitro было показано, что FoxA2 также влияет на экспрессию гена Sox9 [42], однако неизвестно, имеет ли место данное взаимодействие in vivo и на данной стадии.
Pdx1 связывается с регуляторной областью гена Sox9, и наоборот [34], что указывает на возможность взаимной регуляции экспрессии друг друга. Однако зависимость экспрессии Pdx1 от Sox9 наблюдается на более поздних стадиях [43]. Поддержание экспрессии генов Sox9 и Pdx1 может также происходить за счет авторегуляции [26, 42, 44].
Формирование пула МПК с панкреатической программой развития
Активированные на раннем этапе мастер-регуляторы отвечают за активацию и поддержание генной сети, обеспечивающей панкреатический путь развития клеток (см. рис. 3, а). Sox9 кооперируется с Pdx1 для активации генов панкреатического пути Ptf1a и Nkx6.1 и подавления генов интестинального пути [34]. Факторы Pdx1 и Foxa2 кооперируются для связывания с энхансером гена PTF1a [45]. Активация генов ведет к пролиферации клеток с заложенной в них панкреатической программой. Sox9 наряду с другими мастер-генами играет важную роль в поддержании пула МПК за счет стимуляции их пролиферации и поддержания их в недифференцированном состоянии [32]. При этом Sox9 поддерживает экспрессию своего гена петлей положительной обратной связи, контролируемой сигнальным путем FGF [46].
Разделение на проацинарные и бипотентные прогениторные клетки
На втором этапе начинается дифференцировка клеток, при которой разные сочетания активированных генов начинают отвечать за определенные пути развития и активируют соответствующие иерархически ниже расположенные гены. Ветви генной сети, отвечающие за альтернативный путь развития, выключаются. Так, при разделении МПК на проацинарные клетки головки и бипотентные клетки ствола в первых остается активным фактор Ptf1a, а количество Sox9 снижается [47], в зрелых ацинарных клетках экспрессия Sox9 отсутствует вовсе [48, 49]. Репрессором Sox9 может выступать Ptf1a, так как было показано, что эктопическая экспрессия его гена подавляла экспрессию Sox9 [50], а при выключении гена Ptf1a в зрелых ацинарных клетках происходила реактивация гена Sox9 [51].
В противовес, в бипотентных прогениторных клетках сохраняется экспрессия гена Sox9 совместно с Pdx1 и Nkx6.1, но не Ptf1a, и в дальнейшем он принимает важное участие в регуляции выбора эндокринного или протокового путей развития на следующем этапе развития клеток.
Sox9 — ключевой фактор дифференциации бипотентных клеток
Инактивация Sox9 на этом этапе вызывает невозможность данной дифференцировки и приводит к образованию неполноценных протоковых клеток. Частичная инактивация Sox9, обусловленная моноаллельной экспрессией гена, приводит к гипоплазии эндокринной части (50% массы) при образовании полноценной экзокринной части [52].
За запуск процесса дифференциации бипотентных клеток отвечает сигнальный путь Notch (см. рис. 3, б). Умеренная активация пути Notch в клетках стимулирует экспрессию Sox9, который является активатором Ngn3 (Neurogenin3), ключевого гена в развитии эндокринных клеток [53]. Активация Ngn3 также происходит при участии факторов Pdx1, Hnf6, FoxA2 и Hnf1β, взаимодействие между которыми показано на рис. 3б [43, 54—57]. В дальнейшем Ngn3 вызывает подавление экспрессии гена Sox9, при этом происходит запуск эндокринного пути развития клеток [53]. Ngn3 отвечает за деламинирование эндокринных клеток посредством посттранскрипционной регуляции активности Snai2 (Slug), являющегося репрессором гена маркера эпителиальных клеток E-кадгерина. Эта последовательность событий запускает ЭМП (эпителиально-мезенхимальный переход), посредством которого эндокринные клетки открепляются от сформировавшейся сети эпителиальных клеток и распределяются по ней с последующим образованием кластеров, дающих начало островкам Лангерганса [58].
С другой стороны, повышенная активация сигнального пути Notch вызывает активацию гена Hes1, являющегося репрессором Ngn3, за счет этого сохраняется экспрессия Sox9, и далее эта часть клеток дифференцируется в протоковые клетки [53].
Роль Sox9 во взрослой ПЖ
Pdx1, Sox9 и Ptf1a совместно с другими факторами (см. таблицу) контролируют дальнейшее развитие β-, протоковых и ацинарных клеток соответственно и участвуют в поддержании их клеточной идентичности во взрослой ПЖ [9, 51, 53, 59]. Экспрессирующие Sox9 протоковые и центроацинарные клетки, расположенные в участке между протоковыми и ацинарными клетками, отвечают за поддержание гомеостаза экзокринной части ПЖ [48]. Также для Sox9 была показана его связь с процессом регенерации ПЖ при повреждениях [26]. Регенерационный потенциал во взрослом органе скорее связан с Ptf1a+ ацинарными клетками, в которых при повреждении ПЖ происходит факультативная реактивация мультипотентных факторов Sox9 и Hnf1β. В результате происходит ацинарно-протоковый переход (АПМ — ацинарно-протоковая метаплазия), во время которого ацинарные клетки приобретают протоковый фенотип и могут дать начало эндокринным клеткам [47]. Ацинарно-протоковый переход лежит также в основе возникновения протоковой аденокарциномы ПЖ (ПАПЖ).
Sox9 как ключевой участник развития ПАПЖ
ПАПЖ является одним из самых агрессивных видов злокачественных поражений. Прогноз при данном заболевании, как правило, неблагоприятный. В течение 5 лет после установления диагноза в живых остаются менее 9% больных [60]. Во многом это связано с трудностями ранней диагностики, обширным метастазированием на момент постановки диагноза и гетерогенностью опухоли, которая объясняет низкую восприимчивость к традиционным методам терапии.
Ацинарные клетки — предшественники ПАПЖ
Согласно современной концепции развития ПАПЖ, клетками-родоначальниками ее классического подтипа являются ацинарные клетки. Ключевым инициирующим событием является ацинарно-протоковая метаплазия [61, 62]. Этот процесс активируется при остром панкреатите и непосредственно связан с регенерацией ПЖ. В норме это заканчивается редифференциацией «протоковых» клеток в ацинарные [63], однако при появлении дополнительных факторов может происходить нарушение клеточной и тканевой архитектуры в виде формирования панкреатической интраэпителиальной неоплазии различной степени (ПанИН-I, II, III), которая в конечном итоге может прогрессировать в инвазивную аденокарциному [64, 65].
При запуске АПМ в ацинарных клетках происходит активация факторов транскрипции Sox9, Pdx1, Hnf6, Hnf1β, Hes1, характерных для бипотентных прогениторных клеток [66—68], а также факторов Klf4 и Klf5 [69, 70]. Для ряда из них, например Klf4, Klf5, Pdx1 и Hnf6, в серии работ была показана их роль в возникновении АПМ и ее прогрессии в ПАПЖ [68—72], но особое внимание уделяется Sox9 и многочисленным способам активации его гена (рис. 4, а).
Активация Sox9 в ацинарных клетках необходима для начальной фазы ПАПЖ
Одной из наиболее частых причин возникновения ПАПЖ являются онкогенные мутации гена Kras, приводящие к тому, что его белковый продукт находится в состоянии постоянной функциональной активности [73]. На фоне этого происходит инактивация фактора p27 — репрессора гена Sox9 [66] и запускается NFκB-сигнальный путь, способствующий активации гена Sox9 [74]. Дополнительным фактором активации Sox9 при мутациях Kras может выступать и активация гена Klf5 [70]. Мутации гена Kras в ацинарных клетках являются пусковым механизмом для АПМ, но этого оказывается недостаточно для возникновения ПАПЖ. Для индукции канцерогенеза необходимы возникающие на фоне хронического панкреатита воспалительные сигналы, которые включают сигнальный путь EGFR [64, 75], приводящий к экспрессии гена NFATc4, являющегося активатором гена Sox9 [76, 77]. В свою очередь Sox9 активирует экспрессию гена ERBB2, являющегося следующим звеном EGFR-сигнального пути [78]. Помимо этого, непосредственным индуктором экспрессии гена Sox9 может выступать изоформа B фактора Prrx1, активация которой происходит и при остром панкреатите, и при мутациях Kras [79]. Таким образом, ПАПЖ возникает вследствие комбинации генетических (мутация Kras) и негенетических (повреждение ткани) причин [64], совместное действие которых приводит к активации гена Sox9.
Как видно, Sox9 является необходимым элементом для начальной фазы ПАПЖ, при этом стоит отметить, что Sox9 не может служить надежным маркером для дифференциации хронического панкреатита и ПАПЖ, но может служить маркером протокового типа неоплазии ПЖЖ [49].
Sox9 подавляет инициацию ПАПЖ из протоковых клеток
В более редких случаях, помимо ПанИН, источником ПАПЖ могут выступать внутрипротоковая папиллярно-муцинозная опухоль (ВПМО) и муцинозная цистаденома (МЦА) [62, 80]. Источником ВПМО являются протоковые клетки [81, 82]. В модели возникновения ВПМО мутантная форма Kras и инактивация фактора Brg1 вызывают дедифференциацию протоковых клеток в процессе, обозначенном как «протоковая ретрогрессия» [82] (см. рис. 4, б). В ходе ретрогрессии происходят активация Pdx1 и подавление Sox9, при этом эктопическая активация Sox9 в таких клетках предотвращает ретрогрессию и запуск ВПМО [82].
Как видно, Pdx1 и Sox9, являющиеся партнерами при ПанИН, в случае ВПМО могут играть противоположные роли. При этом в первом случае активация Sox9 связана с дедифференциацией соответствующих клеток ПЖ, а во втором — с подавлением этого процесса. Такое явление, когда активность одного и того же гена в зависимости от источника опухолевых клеток или стадии опухолевого процесса, т. е., как говорят, в «зависимости от контекста», может приводить к разным последствиям в судьбе клетки, не является уникальным и обнаруживается и у других генов. В частности, Brg1 подобно Sox9 препятствует дедифференциации протоковых клеток и способствует дедифференциации ацинарных клеток [81], также он поддерживает опухолевую прогрессию на более поздних стадиях ПАПЖ за счет участия в индукции ЭМП [82]. Klf4 способствует прогрессии АПМ в ПанИН [69], однако на более поздних стадиях развития опухоли выступает онкосупрессором [83].
Причину такой зависимости роли гена от «контекста» можно объяснить его участием в разных сигнальных каскадах и ветвях ген-регуляторных сетей, которое в свою очередь может определяться его партнерами, наличием разных изоформ продукта его экспрессии, возникающих в ходе альтернативного сплайсинга, а также посттрансляционными модификациями [84—86]. С точки зрения биологии такие свойства генов позволяют создавать сложные организмы с множеством тканей и органов при ограниченном наборе генов, но при этом затрудняют их исследование.
4 основных подвида ПАПЖ. Роль ЭМП
Дополнительную сложность в исследование канцерогенеза вносит и гетерогенность популяции опухолевых клеток, когда разные клетки опухоли по-разному реагируют на внешние воздействия. Согласно современной классификации, на основе полногеномного анализа выделяют 4 основных подвида ПАПЖ — плоскоклеточный (квазимезенхимальный), эмбрионально-прогениторный (классический), иммуногенный и эндокринно-экзокринный [87]. В зависимости от потребностей в функциях, выполняемых генами-регуляторами, в разных подвидах опухолей может происходить их активация или репрессия. Например, фактор PDX1 активен в классическом типе ПАПЖ и отвечает за пролиферацию клеток и рост опухоли, однако в квазимезенхимальном типе экспрессия его гена подавляется, что является необходимым условием запуска ЭМП, необходимого для метастазирования [72, 88, 89].
Фактор Foxa2, являющийся антагонистом фактора Snail (SNAI1) в регуляции экспрессии гена эпителиального маркера E-кадгерина, также отвечает за ингибирование ЭМП, поэтому экспрессия его гена в метастазирующей опухоли также подавляется, при этом в дифференцированных раковых клетках экспрессия Foxa2 присутствует [90].
Для SOX9 также обнаруживаются различия в уровнях экспрессии [88], но в отличие от Pdx1 и FoxA2 Sox9, очевидно, способствует ЭМП. В клетках ПЖ, подвергшихся АПМ, подавление ATM-киназы приводило к запуску ЭМП при сопутствующей активации генов Sox9, маркера мезенхимальных клеток N-кадгерина и факторов-активаторов ЭМП Snail (Snai1)и Slug (Snai2) [91]. Связь Sox9 с ЭМП была показана и для опухолей других органов. Например, выключение SOX9 в раковых клетках щитовидной железы блокирует ЭМП [92]. Подавление SOX9 в клетках рака простаты вызывает снижение уровня одного из основных регуляторов ЭМП фактора ZEB1, но не оказывает влияния на представленность других факторов ЭМП, таких как TWIST, SNAIL и SLUG [93].
Sox9 в стволовых раковых клетках
Согласно ряду гипотез, ЭМП может приводить к возникновению стволовых раковых клеток, представляющих собой особую популяцию онкогенных клеток, устойчивых к внешним воздействиям и способных к самовозобновлению, дифференциации, инвазии, миграции [94]. SOX9 является маркером стволовых раковых клеток в гепатоцеллюлярной карциноме [95], раке молочной железы [96] и др. Подавление экспрессии гена SOX9 в клетках PANC-1 и Capan-1 снижает уровень маркеров стволовых клеток CD44 и CD24 и уменьшает онкогенность данных клеток [97]. Наличием стволовых раковых клеток объясняется устойчивость ПАПЖ к традиционным методам терапии. Было показано, что клетки с высоким уровнем экспрессии SOX9 (PANC-1, Capan-1) более устойчивы к обработке химиотерапевтическим препаратом гемцитабином в сравнении с клетками с низким уровнем SOX9 (BxPC-3, MiaPaCa-2), подавление экспрессии гена SOX9 в PANC-1 усиливало чувствительность к препарату [97]. В связи с этим SOX9 становится привлекательной мишенью для направленной противоопухолевой терапии, заключающейся в доставке в опухоль ингибиторов его экспрессии в сочетании с классическими терапевтическими препаратами.
Заключение
Исследование факторов, принимающих участие в развитии и злокачественном перерождении ПЖ, выявило важную роль SOX9, что позволяет отнести его к одному из основных мастер-регуляторов панкреатической программы и делает многообещающей мишенью таргетной противоопухолевой терапии. При этом информация, полученная в последнее время, показывает, что на разных стадиях развития ПЖ и опухолевой прогрессии SOX9 функционирует в сочетании с другими регуляторными факторами, и репертуар этих факторов меняется в ходе жизненного цикла. Данные результаты укладываются в концепцию о том, что именно взаимодействие транскрипционных факторов с их корегуляторами, а также кооперация транскрипционных факторов на регуляторных участках генов определяет уровень экспрессии последних, и, как следствие, судьбу клетки [85, 98]. Однако, несмотря на обширность накопленного материала, общая картина функционирования таких интерактомов пока носит довольно разрозненный и поверх-ностный характер. Более того, функции одиночных транскрипционных факторов также нуждаются в уточнении. Так, в случае SOX9 недавно было показано, что, помимо регуляции уровня транскрипции целевых генов, он также принимает активное участие в сплайсинге [99]. Таким образом, именно выявление функциональной активности генных продуктов, а также их положение в сложной иерархии ген-регуляторных сетей позволит приблизиться к пониманию основ функционирования клеток и причин их перерождения, и, как следствие, разработке новых терапевтических подходов. Это в полной мере относится и к факторам развития ПЖ, в том числе SOX9.
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14−50−00131).
Acknowledgments. This work was supported by the Russian Science Foundation (Project No. 14−50−00131).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Сведения об авторах
Буланенкова С.С. — е-mail: sun-lioness@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5304-4590
Снежков Е.В. — е-mail: cell6370@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8421-9728
Акопов С.Б. — е-mail: sergeyakopov@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-3000-8025
Автор, ответственный за переписку:
Буланенкова С.С. — е-mail: sun-lioness@mail.ru
Как цитировать:
Буланенкова С.C., Снежков Е.В., Акопов С.Б. SOX9 как одно из центральных звеньев оси регуляции эмбрионального развития и прогрессии рака поджелудочной железы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(3):113-121. https://doi.org/10.17116/molgen201937031