Lactobacillus fermentum 90 TC-4 используется для производства фармацевтических препаратов, пробиотиков в форме биологически активных добавок (БАД) к пище и продуктов питания. Изначально этот штамм выделен на кафедре микробиологии Тартуского государственного университета (Эстония) от здорового человека. В результате изучения биологических свойств установлена его принадлежность к виду L. fermentum [1]. Штамм отличается технологичностью, проявляет выраженный антагонизм против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, но подробное изуче-ние штамма и его свойств ранее проводили лишь с использованием фенотипических методов [1]. Позднее в комплекс методов, используемых для изучения и контроля производственных и перспективных для производства штаммов, введены методики, основанные на изучении отдельных генетических детерминант, что отвечает требованиям МУК 4.2.2602−10¹ и МУ 2.3.2.2789−10². Согласно этим нормативным документам, для обеспечения безопасности и пригодности пробиотиков их штаммы-продуценты должны быть изучены с использованием современных молекулярно-генетических методов для подтверждения отсутствия трансмиссивных генов антибиотикорезистентности, генов вирулентности, островков патогенности и интегрированных плазмид. Но и такой подход в настоящее время уже не является достаточным для характеристики пробиотических штаммов. NGS секвенирование генома штамма позволяет провести углубленный анализ и не только установить наличие или отсутствие детерминант, перечисленных выше, и их геномный контекст, но и изучить другие участки генома, например CRISPR-локус, анализ которого позволит сделать вывод о взаимодействии клеток указанного штамма с фагами в прошлом и выявить детерминанты, перспективные для внутривидового типирования [2, 3]. У пробиотических штаммов рода Lactobacillus несомненный интерес также представляют детерминированные в геноме пути транспорта и метаболизма сахаров, поскольку их классическая микробиологическая идентификация основана именно на сахароли-тических свойствах [4].

В работе использовали штамм Lactobacillus fermentum 90 TC-4 из Государственной коллекции лактобацилл ФБУН «ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, полученный от авторов штамма при совместной работе над лактобактерином [5].

Культивирование штамма. Для восстановления и рассева штаммов бактерий рода Lactobacillus после вскрытия ампулы лиофильную массу заливали 1 мл среды МРС-1 («Lactobacillus MRS broth, HiMedia», Индия), переносили в стерильную пробирку и инкубировали при 37 °C 24 ч (I генерация штамма). На 2-е сутки 0,5 мл культуры I генерации пересевали на МРС-1 и инкубировали при 37 °C 24 ч (II генерация штамма). Далее штамм II генерации рассевали из разведений (10^–4—10^–7) по 0,05 мл на плотную среду МРС-4 (Lactobacillus MRS agar, HiMedia, Индия) и инкубировали 48 ч при 37 °C в анаэробных условиях с использованием газогенерирующих пакетов («Gas Pak Anaerobe Gas Generating Pouch System with Indicator, Becton Dickinson», США).

Идентификация штамма. Выросшие колонии микроорганизмов идентифицировали с использованием времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex («Bruker Daltonics», Германия), для дальнейшей работы отбирали культуры, по результатам масс-спектрометрии имевшие значения Score 2,100 и более.

Изучение биохимических свойств. Биохимические свойства штамма подтверждали с использованием тест-системы API 50 CHL («BioMerieux», Франция).

Полногеномное секвенирование. Для проведения полногеномного секвенирования геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора QIAamp DNA MiniKit (QIAGEN, Германия), фрагментацию производили с использованием системы ультразвуковой фрагментации Covaris E210 («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя. Очистку смеси и отбор фрагментов 200—700 п.н. проводили при помощи магнитных частиц Agencourt AM Purebeads («Beckman Coulter», США) и буфера NEB Next Sizing Buffer («New England Biolabs», США). Подготовку библиотек осуществляли с помощью набора TrueSeq («Illumina Inc», США), секвенирование выполняли на платформе MiSeq («Illumina»). Исходные риды были обработаны утилитой Trimmomatic со стандартными параметрами для Illumina. Затем обработанные риды использовали для сборки генома de novo при помощи программ Spades, MIRA 4.0, Newbler 2.6.

Аннотация генома. Аннотацию генома производили с помощью утилиты Prokka v. 1.11 [6], геномного сервера RAST [7] и BASys (https://www.basys.ca). Изучение CRISPR-кассеты, поиск детерминант антибиотикорезистентности и патогенности проводили с использованием программных продуктов, представленных на сайте Центра геномной эпидемиологии (www.cge.cbs.dk): программ ResFinder 2.0, Pathogen Finder и Crispr Finder [8—10].

Проведение MLST. При MLST типировании для проведения анализа аллелей использована схема, предложенная T. Dan и соавт., основанная на анализе 11 генов «домашнего хозяйства» [11].

Сборка генома. Была произведена сборка генома de novo, в результате собрано 93 контига со средним покрытием 254.12. Общая длина всех контигов составила 1.822.484 н.о., N50 — 36919 п.н., GC состав — 51,9%. В процессе аннотации и анализа генома определены 1420 последовательностей, кодирующих белки, 54 последовательности тРНК, 11 — рРНК и 1 CRISPR-локус. Драфт генома депонирован в международной базе данных GenBank под номером LBDH00000000.

При сравнительном анализе драфта генома исследуемого штамма с последовательностями геномов вида L. fermentum, доступными в базе данных NCBI, установлено, что наиболее близким к исследуемому оказался штамм L. fermentum NCDC 400 (PDKX00000000.1) — идентичность составила 89%.

Аннотирование. При аннотации с использованием RAST установлено, что в геноме представлены 283 функциональные подсистемы. Наибольший процент генов — 14,5% (173 гена) в исследуемом драфте генома соответствует подсистеме «Аминокислоты и их производные», 11,1% (133 гена) приходится на детерминанты утилизации сахаров, 10,7% (128 генов) соответствует подсистеме «Белковый метаболизм», 9,3% (111 генов) — подсистеме «Кофакторы, витамины, простетические группы, пигменты».

С использованием приложения KEGG Metabolic analy-sis установлено, что L. fermentum 90 TC-4 обладает необходимым комплексом ферментов пентозофосфатного пути и ферментами, обеспечивающими транспорт и метаболизм гексоз и пентоз. Большинство ферментов пентозофосфатного пути сосредоточено в пределах 99 и 169 контигов.

Исследование детерминант метаболизма сахаров. Фенотипически данный штамм обладает способностью утилизировать лишь отдельные сахара — D-глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мальтозу, мелибиозу, раффинозу, гидролизовать эскулин и глюконат калия. L. fermentum 90 TC-4 не способен утилизировать рибозу, сахарозу, арабинозу и маннозу, хотя более 80% лактобацилл этого вида утилизируют эти сахара [4].

Детальный анализ сегмента генома, отвечающего за транспорт и утилизацию сахаров, позволил выявить некоторые структурные особенности: отсутствие соответствующей фосфоенолпируватной системы (PTS_ScrA) для сахарозы; отсутствие высокоаффинной пермеазы RbsD для рибозы; отсутствие PTS_Tre и других генов метаболизма трегалозы (трегалозо-6-фосфат гидролазы, трегалозо-6-фос-фат фосфорилазы, регуляторного белка TreR) и полное отсутствие арабинозного оперона. Обнаружены гены транспортных систем для маннозы, глюкозы и фруктозы (PTS WU69_06895; WU69_07500; WU69_05015), специфической пермеазы GPH-семейства (WU69_07335) и β-галактозидазы (WU69_08605), отвечающие за поступление в клетку и метаболизм галактозы, лактозы и галактоолигосахаридов. Также выявлены детерминанты, кодирующие мальтозофосфорилазу (WU69_03215), ответственную за метаболизм мальтозы, и установлено отсутствие в геноме специфичного ABC-транспортера MalEFG/MsmK для данного субстрата. Обнаружены детерминанты, кодирующие пермеазу WU69_07335 и ферменты метаболизма мелибиозы и раффинозы: α-галактозидазы (WU69_07340) и сахарозо-6-фосфат гидролазы (WU69_07660).

Доказательство безопасности штамма. В ходе анализа генома с использованием программы Pathogen Finder отдельных детерминант и островков патогенности не было обнаружено. Поскольку ранее было установлено, что фенотипически штамм L. fermentum 90 TC-4 обладает резистентностью к ряду антибактериальных препаратов — аминогликозидам, хлорамфениколу, цефалоспоринам, фторхинолонам [12], полученная последовательность генома проанализирована с целью поиска соответствующих детерминант антибиотикорезистентности.

При использовании программы ResFinder детерминант резистентности к перечисленным выше антибиотикам выявлено не было, однако с помощью RAST были обнаружены две детерминанты, отнесенные программой к группе «β-лактамазы и пенициллинсвязывающие белки», — WU69_03125 и WU69_02400. С использованием BLAST белок WU69_03125 был идентифицирован как пенициллин связывающий белок (белок pbpX), а WU69_02400 отнесен к группе сериновых гидролаз, т. е. потенциально он может являться β-лактамазой, которая обеспечивает устойчивость штамма к цефалоспоринам. Но при использовании сервера для аннотации геномов BASys (https://www.basys.ca) белок WU69_02400 был распознан как пенициллинсвязывающий белок и установлен его гомолог — penicillin binding protein pbp4B E. coli K-12 (GI87082101). С использованием RAST был изучен геномный контекст и установлено, что данные детерминанты расположены вне транспозонов и интегронов и не входят в состав встроенной плазмиды.

Затем был выполнен анализ нуклеотидных последовательностей в консервативной области генов GyrA и ParC, кодирующих A-субъединицу ДНК-гиразы (WU69_03325) и A субъединицу топоизомеразы IV (WU69_01385) соответственно. Был проведен поиск аминокислотных замен, которые обычно обусловливают устойчивость бактерий к фторхинолонам, так как приводят к изменению конфигурации данных белков, образующих так называемый хинолоновый карман [13, 14]. Значимые замены как для GyrA — Ser83Phe/Tyr/Ala и Asp87 Gly/Asn/Tyr, так и для ParC — Glu84Lys и Ser80Leu выявлены не были.

Других детерминант антибиотикорезистентности в геноме не обнаружено, но выявлены гены, кодирующие эффлюксные помпы, принадлежащие к семейству MATE (WU69_06475, WU69_04310) и MFS (WU69_RS09275, WU69_06990).

Анализ CRISPR-локуса. С целью поиска штаммоспеци-фичных особенностей был проанализирован CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) — локус штамма, содержащий высококонсервативные белки (Cas-белки) и короткие палиндромные повторы, разделенные спейсерами. CRISPR — механизм, защищающий клетку от «генетической агрессии» и предотвращающий проникновение в клетку бактериофагов и плазмид [15].

Установлено, что данный оперон находится в пределах 212 контига (NCBI:NZ_LBDH01000009), в его структуру входят комплекс cas-белков и 22 повтора, длиной 28 нуклеотидов, которые разделяют 21 уникальный спейсер (cм. рисунок).

При анализе организации оперона и представленности Cas-белков (наличие CAS3 белка) выявлено, что система CRISPR/Cas данного штамма относится к I типу [16]. При исследовании палиндромного повтора с использованием BLAST установлено, что его последовательность аналогична последовательности повтора CRISPR—Cas системы штамма L. Fermentum F-6. А при анализе последовательности спейсеров выявлено, что два из них гомологичны нуклеотидным последовательностям фагов лактобацилл — Lactobacillus phage LF1 (HQ141410) и Lactobacillus phage Lfe Inf (KP054477), принадлежность остальных спейсеров установить не удалось.

MLST-анализ. Проанализированы также отдельные гены «домашнего хозяйства» исследуемого штамма с целью мультилокусного сиквенстипирования (MLST) исследуемого штамма.

Фрагменты генов L. fermentum 90 TC-4 сравнивались с нуклеотидными последовательностями, представленными в научной литературе [10], при полном совпадении последовательности исследуемого изолята с референсной присваивался соответствующий номер аллели (см. таблицу).

Установлено, что последовательность murC содержит точечную замену T/C в позиции 716 п.н., что не позволило отнести детерминанту ни к одной из 12 ранее описанных аллелей, поэтому новой аллели был присвоен порядковый номер 13. Полученный в результате анализа аллельный профиль не соответствует ни одному из описанных ранее сиквенс-типов.

Штамм L. fermentum 90 TC-4 относится к облигатно гетероферментативным лактобациллам группы С, у которых основным путем метаболизма углеводов является пентозофосфатный путь [4], что связано с отсутствием ключевого фермента гликолиза — фосфофруктокиназы и наличием фосфокетолазы. Поступление различных субстратов в клетки исследуемого штамма регулируется как с помощью специфических (для глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы) фосфоенолпируватных систем или пермеаз, так и с помощью неспецифических пермеаз или H+ симпорта в случае мелибиозы, раффинозы и мальтозы. Фенотипические особенности штамма — неспособность к утилизации рибозы, сахарозы, арабинозы и маннозы — могут быть объяснены отсутствием в геноме детерминант, кодирующих соответствующие транспортные системы и некоторые метаболические ферменты, или их экспрессии.

Так, исследуемый штамм содержит в геноме полный оперон утилизации D-маннозы, состоящий из 7 генов: регуляторного manO, маннозо-6-фосфат изомеразы manA, фосфоманномутазы manB и специфичной PTS (manXb, manXa, manY, manZ), который, однако, не проявляется фенотипически. Согласно классификации RAST, метаболический вариант представленного оперона — 1.11, что указывает на полный набор генов и возможность утилизации внеклеточной маннозы. Вероятно, гены маннозного оперона у исследуемого штамма не экспрессируются и не проявляют себя фенотипически в силу изменения среды обитания штамма и дефицита этого субстрата в организме человека.

Способность к утилизации рибозы и сахарозы характерна для 95 и 86% штаммов вида L. fermentum [4]. Гены утилизации этих сахаров в геноме L. fermentum 90 TC 4 представлены частично. В состав оперона утилизации рибозы входят гены рибокиназы RbsK, репрессора оперона RbsR и фермента рибозо-5-фосфат изомеразы, ген специфической пермеазы RbsD не представлен. Обращает на себя внимание тот факт, что, по данным RAST, в геномах штаммов, способных к утилизации рибозы (L. brevis, L. plantarum), присутствует полный оперон, включая RbsD. В геномах штаммов L. delbrueckii и L. helveticus, которые, по данным литературы [4], не способны утилизировать рибозу, оперон также представлен частично (гены рибокиназы RbsK и рибозо-5-фосфат изомеразы), ген пермеазы RbsD отсутствует.

Путь утилизации сахарозы также детерминирован частично, включает ген фруктокиназы FruK и регуляторные гены ScrR и CscR, гены транспортной системы PTS ScrA отсутствуют. Такое строение оперона, по данным RAST, характерно и для штаммов других видов, не способных утилизировать сахарозу — L. delbrueckiis sp. buigaricus и L. helveticus, в то время как представители видов L. acidophilus и L. plantarum, обладающие способностью утилизировать сахарозу, имеют полный оперон, включая транспортную систему.

В геноме штамма полностью отсутствует оперон утилизации L-арабинозы. Согласно данным литературы, около 30% штаммов вида L. fermentum способны утилизировать этот моносахарид [4], в геномах отдельных штаммов данного вида этот оперон также отсутствует (L. fermentum ATCC 14931), у других штаммов (L. fermentum IFO 3956, L. fermentum CECT 5716) присутствует в полном объеме, как и у представителей других видов лактобацилл, способных метаболизировать арабинозу, — L. plantarum, L. brevis, L. reuteri.

Таким образом, неспособность к утилизации рибозы и сахарозы штаммом L. fermentum 90 TC 4 связана с потерей генов соответствующих транспортных систем — высокоаффинной пермеазы RbsD и фосфоенолпируватной системы PTS_ScrA, а арабинозы — c полным отсутствием соответствующего оперона. Вероятно, эти особенности являются результатом эволюционной редукции генома микроорганизма, имеющего ограниченный ареал обитания — организм человека. Необходимо отметить, что низкая сахаролитическая активность штамма является его характерной особенностью и может быть использована в качестве «метки штамма».

Другой важный вопрос — анализ генома на наличие детерминант устойчивости к антибиотикам, патогенности и интегрированных плазмид. Известно, что к антибиотикам из группы пептидов (ванкомицин, тейкопланин) представители рода Lactobacillus обладают природной устойчивостью за счет прочности клеточной стенки и отсутствия цитохромзависимого электронного транспорта [17]. Благодаря ранее проведенным исследованиям L. fermentum 90 TC-4 имеет изученный профиль антибиотикорезистентности, обладает устойчивостью к следующим антибиотикам: гентамицину (MIC 50 мкг/мл), цефотаксиму (MIC 64 мкг/мл), цефепиму (MIC 16 мкг/мл), ципрофлоксацину (MIC 500 мкг/мл), фуразолидону (MIC 500 мкг/мл), эритромицину (MIC 2,5 мкг/мл), тетрациклину (MIC 25 мкг/мл), ванкомицину (MIC 256 мкг/мл) и сульфаниламидам (MIC12800 мкг/мл) [12]. В результате анализа драфта генома L. fermentum 90 TC-4 обнаружены две детерминанты антибиотикорезистентности. Они распознаны как пенициллинсвязывающие белки, расположены вне транспозонов и интегронов и не входят в состав встроенной плазмиды. При анализе генома также не выявлено точечных мутаций и в первичной мишени хинолонов — консервативной области QRDR-генов, т. е. устойчивость данного микроорганизма к фторхинолонам обусловлена, вероятно, наличием эффлюксных помп семейств MATE и MFS, которые могут обусловливать устойчивость штамма к различным антимикробным препаратам. Факт о важности механизмов эффлюкса в формировании антибиотикорезистентности представителей рода Lactobacillus находит подтверждение и в литературе [18]. В ходе анализа генома с использованием Plasmid Finder и Pathogen Finder детерминант патогенности, островков патогенности и интегрированных плазмид не было обнаружено, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к производственным и производственно-перспективным штаммам пробиотиков.

Определенный интерес представлял анализ обнаруженной в геноме исследуемого штамма CRISPR-кассеты. Поскольку последовательности CRISPR региона не коррелируют с филогенией и их строение может отличаться даже у разных штаммов одного вида, данная область генома очень перспективна в плане типирования микроорганизмов [19, 20]. Несмотря на то что области палиндромных повторов в CRISPR-регионе L. fermentum 90 TC-4 не являются уникальными и аналогичны последовательности повтора CRISPR—Cas системы штамма L. fermentum F-6, в данном участке генома присутствуют неидентифицированные спейсерные последовательности, которые могут являться перспективными для дальнейшего поиска «метки штамма».

В настоящее время для типирования штаммов наиболее широко используется метод мультилокусного сиквенстипирования (MLST), предполагающий установление аллельных профилей отдельных генов «домашнего хозяйства» исследуемого штамма. Комбинация аллельных профилей генов и формирует конкретный сиквенс-тип (ST), при установлении которого можно более полно характеризовать штамм, определить его принадлежность к какому-либо клону [21]. Ранее для этого использовали отдельные геномные детерми-нанты — 16SrRNA, pheS, а также ряд генов, присутствующих в схеме MLST, использованной в данном исследовании [22—24]. Централизованные общедоступные базы данных для L. fermentum пока отсутствуют, поэтому при проведении анализа аллельного профиля штамма были использованы данные научной литературы, полученные для микроорганизмов пищевого происхождения (кумыс и другие кисломолочные напитки) преимущественно из Монголии и Тибета, в то время как L. fermentum 90 TC-4 выделен на территории Эстонии от здорового человека. Это объясняет несоответствие аллельного профиля исследуемого штамма ни одному из описанных сиквенс-типов и подтверждает необходимость создания базы данных нуклеотидных последовательностей изолятов лактобацилл, использующихся в российской пищевой и фармацевтической промышленности.

Таким образом, в ходе проведенного исследования установлены основные характеристики генома L. fermentum 90 TC-4, подтверждено отсутствие в геноме детерминант антибиотикорезистентности, патогенности и вирулентности. Показано, что низкая сахаролитическая способность штамма связана с отсутствием оперона утили-зации L-арабинозы и отдельных транспортных систем — специфичной для сахарозы PTS_ScrA и специфичной для рибозы пермеазы RbsD. Проанализирован CRISPR-Cas локус штамма, выявлены уникальные спейсеры, перспективные для штаммовой индикации, определены генетические основы антибиотикорезистентности штамма. Подтверждено, что штамм удовлетворяет современным требованиям к производственным штаммам и может использоваться в качестве продуцента пробиотиков.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Точилина А.Г. — е-mail: lab-lb@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7753-5730

Белова И.В. — е-mail: lab-lb@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-3402-1160

Соловьева И.В. — е-mail: lab-lb@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-3136-9500

Иванова Т.П. — н е-mail: lab-lb@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-4076-0621

Жирнов В.А. — е-mail: lab-lb@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1162-2417

Автор, ответственный за переписку:

Точилина А.Г. — е-mail: lab-lb@yandex.ru

Как цитировать:

Точилина А.Г., Белова И.В., Соловьева И.В., Иванова Т.П., Жирнов В.А. Биоинформатический анализ генома производственного штамма Lactobacillus fermentum 90 TC-4. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2019;37(3):128-133. https://doi.org/10.17116/molgen201937031

¹Методические указания по контролю биологических и микробиологических факторов. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение прозводственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков: методические указания №4.2.2602-10. М.: Роспотребнадзор; 2011.