В настоящее время аденовирусы широко применяются для доставки и экспрессии трансгенов для терапевтических целей и в фундаментальных исследованиях [1]. Система аденовирусных векторов AdEasy^TM является одной из наиболее часто используемых для быстрого и эффективного создания рекомбинантных репликативно-дефицитных аденовирусов. В системе AdEasy рекомбинантная аденовирусная плазмида создается посредствам гомологичной рекомбинации в клетках E. coli BJ5183 между шаттл-вектором, кодирующим ген интереса, и плазмидой pAdEasy-1, несущей большую часть генома аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). Далее полученная рекомбинантная аденовирусная плазмида трансфицируется в упаковочную клеточную линию (например, HEK293), в которой происходит сборка вирусных частиц и репликация вируса [2, 3].

Создание рекомбинантной аденовирусной плазмиды является одним из важнейших этапов получения рекомбинантных аденовирусов. В исходном варианте системы AdEasy в клетки штамма BJ5183 котрансформируют шаттл-вектор и плазмиду pAdEasy-1, отбирая канамицин-устойчивых рекомбинантов [2]. Повысить эффективность получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды можно за счет создания штамма клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, который получают путем трансформации клеток BJ5183 плазмидой pAdEasy-1. Далее в клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 трансформируют шаттл-вектор, что существенно увеличивает эффективность гомологичной рекомбинации по сравнению с котрансформацией двух плазмид в штамм BJ5183 [4].

Согласно приведенным выше протоколам [2, 4], для получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды в системе AdEasy необходимо проведение электропорации плазмидной ДНК, что требует наличия дорогостоящего оборудования и расходников (кюветы), а также приготовления в лаборатории или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток E. coli. Однако в ряде работ для получения рекомбинатной аденовирусной плазмиды использовали химически компетентные клетки E. coli [5, 6].

Задачей данной работы была оптимизация протокола получения рекомбинатной аденовирусной плазмиды в системе AdEasy с использованием химически компетентных клеток, приготовленных в лабораторных условиях по одной из самых простых методик. В результате с использованием химически компетентных клеток нами были успешно созданы рекомбинантные аденовирусные плазмиды и получены репликативно-дефицитные аденовирусы, экспрессирующие целевые белки. Описанный нами протокол позволяет быстро и эффективно получать рекомбинантные аденовирусные плазмиды с помощью системы AdEasy без проведения электропорации, а также без дополнительной очистки линеаризованного шаттл-вектора.

Плазмиды. Плазмиды pShuttle-CMV и pAdEasy-1 были приобретены у компании «Agilent Technologies» (США). Для создания шаттл-векторов, кодирующих кДНК слитого белка Egfp-Pdcd4 с мутациями в кДНК Pdcd4 RBM12 S457A или RBM12 D235A D418A, NheI (обработан фрагментом Кленова) — SalI фрагменты кДНК клонировали из соответствующих векторов pEgfp-C2-Pdcd4 RBM12 S457A или pEgfp-C2-Pdcd4 RBM12 D235A D418A в вектор pShuttle-CMV по сайтам BglII (обработан фрагментом Кленова) и SalI. Мутантная форма Pdcd4 RBM12, несущая аминокислотные замены K60A, R61A, R62A, R64A, K65A, R102A и R103A, была описана ранее [7]. Точечные мутации вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с помощью метода с двумя комплементарными олигонуклеотидными праймерами на основе протокола QuikСhange Site-Directed Mutagenesis kit («Agilent Technologies»). В качестве матрицы в ПЦР использовали плазмиду pCR-Blunt («Invitrogen», США), несущую кДНК белка Pdcd4 человека, фланкированную сайтами рестрикции EcoRI-SalI. ПЦР проводили с использованием ДНК полимеразы AccuPrime Pfx («Invitrogen») в реакции объемом 50 мкл, включавшей 1-кратный реакционный буфер, 300 нМ прямого и обратного праймеров, 100 нг плазмидной матрицы и 2,5 ед. ДНК-полимеразы при следующих условиях: 94 °C — 3 мин (94 °С — 40 с, 55 °C — 1 мин, 68 °C — 5 мин) — 15 циклов, 68 °C — 3 мин. Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазой DpnI в течение 2 ч для расщепления плазмидной матрицы и трансформировали 10 мкл в химически компетентные клетки E. coli XL-1 Blue MRF’. Мутации в различных участках кДНК Pdcd4 вводили последовательно. Далее кДНК белка Pdcd4 с нужными мутациями субклонировали в вектор pEGFP-C2 («Clontech», США) по сайтам EcoRI-SalI. Для мутагенеза использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: S457A (5`-gcagaaagcgttttgtagccgaaggagatggaggtc-3` и 5`-gacctccatctccttcggctacaaaacgctttctgc-3`); D235A (5’-gggacagtaatgagcacaactgctgtggaaaaatcatttgataaa-3’ и 5’-tttatcaaatgatttttccacagcagttgtgctcattactgtccc-3’); D418A (5’-ttccggacattaatctggctgtcccacattcatactc-3’ и 5’-gagtatgaatgtgggacagccagattaatgtccggaa-3’); K60A, R61A, R62A, R64A, K65A (5’-atcgcctctgccagagtcccgggatgagtttgccgctagtgccgctgctgccttggcattaattctagcttcgttaatg-3’ и 5’-cattaacgaagctagaattaatgccaaggcagcagcggcactagcggcaaactcatcccgggactctggcagaggcgat-3’); R102A, R103A (5’-caaagggaaggttgctggatgcggcatccagatctgggaaagg-3’ и 5’-cctttcccagatctggatgccgcatccagcaaccttccctttg-3’). Для создания шаттл-вектора, кодирующего внутриклеточный домен белка Notch1 крысы (аминокислотные остатки 1749 — 2531) c c-myc эпитопом на C-конце (NICD-myc), EcoRI (обработан фрагментом Кленова) — NotI фрагмент кДНК NICD-myc клонировали из вектора pEgfp-N2-NICD-myc в вектор pShuttle-CMV по сайтам BglII (обработан фрагментом Кленова) и NotI. Вектор для продукции белков с C-концевым c-myc эпитопом (pEGFP-N2-myc) создавали на основе вектора pEGFP-N2 («Clontech») путем клонирования по сайтам BamHI-NotI двухцепочечных олигонуклеотидов, полученных путем гибридизации одноцепочечных олигонуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность c-myc эпитопа (5`-gatccgtcgacgagcagaagctgatctccgaggaggacctgtaagc-3` и 5`-ggccgcttacaggtcctcctcggagatcagcttctgctcgtcgacg-3`). кДНК NICD амплифицировали в ПЦР с праймерами 5`-gaattcgccaccatgaagcgcaggcggcagcat-3` и 5`-gtcgaccttaaatgcctctggaatg-3` и клонировали в вектор pEGFP-N2-myc по сайтам EcoRI-SalI, получая вектор pEgfp-N2-NICD-myc. Для создания шаттл-вектора, кодирующего протеинкиназу Pak5 человека, слитую с Egfp, NheI (обработан фрагментом Кленова) — SmaI фрагмент кДНК Egfp-Pak5 клонировали из вектора pEgfp-C1-Pak5, описанного ранее [8], в вектор pShuttle-CMV по сайту BglII (обработан фрагментом Кленова). Для генно-инженерных манипуляций с плазмидами и получения плазмидной ДНК в препаративных количествах использовали штамм E. coli XL-1 Blue MRF’ («Stratagene», США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli проводили с использованием набора GenElute Plasmid MiniPrep Kit («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Нуклеотидные последовательности всех амплифицированных в ПЦР кДНК верифицировали путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Россия.

Культивирование клеток E. coli. Клетки E. coli культивировали в жидкой среде Miller’s LB broth (0,171 М NaCl, 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт) («BD Bioscience», США) при +37 °С. Для заливки чашек Петри к среде LB добавляли бактериальный агар («BD Bioscience») до концентрации 1.5%. Клетки штамма E. coli BJ5183 («Agilent Technologies») культивировали в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина, клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 — в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл ампициллина, клетки штамма E. coli XL-1 Blue MRF’ — в присутствии 12,5 мкг/мл тетрациклина. В работе использовали следующие реагенты: ампициллин натрия (ОАО «Синтез», Россия), канамицин сульфат (ОАО «Биохимик», Россия), тетрациклин гидрохлорид («Sigma», США), стрептомицин (ОАО «Биохимик»).

Приготовление и трансформация химически компетентных клеток E. coli. Химически компетентные клетки штаммов E. coli BJ5183, E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и E. coli XL-1 Blue MRF’ готовили в соответствии с протоколом, описанным в [9]. В частности, клетки соответствующих штаммов высевали на селективную чашку и растили в течение ночи. На следующий день инокулировали 10 мл ночной культуры среды LB без антибиотиков и растили в течение ночи. С утра переносили 2 мл ночной культуры в 200 мл среды LB без антибиотиков и растили в течение 3—4 ч до достижения оптической плотности 0,45—0,55 при длине волны 600 нм. Клетки охлаждали на льду в течение 2 ч и центрифугировали при 2500 g в течение 15 мин при +4 °С. Осадок ресуcпендировали в ледяном буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaCl₂, 70 мМ MgCl₂) и инкубировали на льду в течение 45 мин. Далее клетки осаждали центрифугированием при 1800 g в течение 10 мин при +4 °С, осадок ресуспендировали в буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaCl₂, 70 мМ MgCl₂, 15% глицерин), суспензию клеток разливали в аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при –80,°С. Трансформацию химически компетентных клеток E. coli проводили, как описано в [9]. В частности, к аликвоте компетентных клеток добавляли 3 мкл диметилсульфоксида, перемешивали, добавляли плазмидную ДНК, перемешивали и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для проведения теплового шока клетки помещали на 50 с в водяную баню (+42 °С), потом быстро переносили в лед и инкубировали на льду 1 мин. Далее суспензию клеток переносили в 1 мл среды LB без антибиотиков и инкубировали клетки при интенсивном перемешивании при +37 °С в течение 1 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием (30 с, 16 000 g), отбирали часть супернатанта и высевали клетки на предварительно прогретые до +37 °С чашки с LB агаром, содержавшим соответствующие антибиотики.

Культуры клеток. Клетки линии HEK293 (European Collection of Cell Cultures, #85120602) культивировали в среде DMEM («HyClone», США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («HyClone»), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Gibco», США). Для трансфекции клеток линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой использовали реагент EcoTransfect («OZ Bioscience», Франция).

Получение рекомбинантных аденовирусов. Рекомбинантные аденовирусные плазмиды, выделенные из клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, трансформировали в клетки E. coli XL-1 Blue MRF’ и выделяли плазмиды в препаративных количествах. Далее, начиная с этапа линеаризации рекомбинантной аденовирусной плазмиды и трансфекции упаковочной клеточной линии HEK293, аденовирусы получали в соответствии с опубликованным протоколом [3]. В частности, 5 мкг рекомбинантной аденовирусной плазмиды линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции PacI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 3 ч в реакции объемом 100 мкл при +37 °С, после чего добавляли 10 мкл 3 М ацетата натрия pH=5,2 и 275 мкл этанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при –20 °С, центрифугировали 10 мин при 14 000 g, промывали осадок два раза 70% этанолом, ресуспендировали в 40 мкл стерильной воды и использовали для трансфекции. Далее клетки линии HEK293 рассевали в количестве 1,4·10⁶ клеток на 60-мм культуральную чашку и на следующий день трансфицировали, используя 4 мкг линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Клетки культивировали в течение 15 (аденовирус NICD-myc), 17 (Egfp-Pdcd4) или 22 дней (Egfp-Pak5), каждые 2—3 дня добавляя к клеткам по 1 мл свежей среды. Далее собирали первичный вирусный сток, для выхода вируса клетки разрушали за счет двух циклов замораживания-оттаивания, после чего проводили три раунда амплификации аденовирусов и инфицирование клеток линии HEK293 вирусным стоком с предыдущего этапа (1 раунд: 3·10⁶ клеток на 60-мм культуральной чашке; 2 раунд: 7·10⁶ клеток на 100-мм культуральной чашке; 3 раунд: 7·10⁶ клеток на пяти 100-мм культуральных чашках). После последнего раунда амплификации аденовирус разливали в аликвоты и хранили при –70 °С.

Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ образцов проводили, как описано в [10], с использованием следующих антител: мышиные моноклональные к c-myc эпитопу, клон 9E10 («Sigma», #M5546, разведение 1:2000); мышиные моноклональные к α-тубулину, клон DM1α, («Sigma», #T9026, разведение 1:5000), мышиные моноклональные к Egfp, клон 3A9, («Протеинсинтез», Россия #PSM001, разведение 1:2000).

В опубликованных протоколах создания рекомбинантных аденовирусов на основе системы AdEasy для трансформации клеток E. coli штаммов BJ5183 или E. coli BJ5183-pAdEasy-1 используется электропорация плазмидной ДНК, что обеспечивает высокую эффективность трансформации, до 1·10⁷ КОЕ/мкг плазмидной ДНК при использовании коммерчески доступных электрокомпетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [2—4]. В ряде других работ сообщалось об использовании химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183 для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид путем котрансформации линеаризованных шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5, 6], без использования штамма, аналогичного штамму E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. При этом проводили очистку шаттл-вектора из агарозного геля и переосаждение линеаризованной аденовирусной плазмиды перед котрансформацией [6] или оптимизацию соотношения количества шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5]. Мы предположили, что протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид можно оптимизировать и упростить за счет использования химически компетентных клеток E. coli, приготовленных по одной из простейших методик, создания клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 для повышения эффективности гомологичной рекомбинации и отказа от очистки линеаризованного шаттл-вектора из агарозного геля перед трансформацией.

Сначала готовили химически компетентные клетки E. coli BJ5183 и трансформировали их плазмидой pAdEasy-1. Эффективность трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183 составляла 3·10⁵ КОЕ/мкг плазмидной ДНК при использовании плазмиды pAdEasy-1 (33.4 т.п.н.). Обычно подобная эффективность считается недостаточной для использования компетентных клеток для генно-инженерных манипуляций, однако при трансформации очищенной плазмидной ДНК, и, учитывая большой размер плазмиды pAdEasy-1, подобная эффективность трансформации позволяет получить достаточное количество колоний на чашке для дальнейшего отбора и анализа корректных клонов. Далее, из нескольких колоний выделяли плазмиду pAdEasy-1 и анализировали ее с помощью эндонуклеаз рестрикции BglII и HindIII. Клетки одного из клонов с корректным паттерном рестрикции плазмиды pAdEasy-1 (данные не показаны) использовали для приготовления глицеринового стока клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и далее готовили химически компетентные клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1.

Для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид были созданы четыре шаттл-вектора, кодирующие слитые белки Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A, Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, Egfp-Pak5 и NICD-myc. В ряде протоколов, включая протокол для коммерчески доступной системы AdEasy от компании «Agilent Technologies» («AdEasy XL Adenoviral Vector System Instruction Manual», Revision C1), указывается на необходимость очистки из агарозного геля шаттл-вектора после линеаризации [5, 6]. Однако было показано использование неочищенного линеаризованного шаттл-вектора для электропорации клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. Мы решили использовать для трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенный шаттл-вектор, обработанный фосфатазой для минимизации рециркуляризации шаттл-вектора в клетках E. coli. 1 мкг соответствующих шаттл-векторов линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MssI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 2 ч в реакции объемом 50 мкл при +37 °С, после чего добавляли 1 ед. щелочной фосфатазы CIAP («Fermentas», #EF0341) и инкубировали еще 30 мин при +37 °С. Затем 5 мкл рестрикционной смеси (эквивалентно 100 нг плазмидной ДНК) трансформировали в химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и отбирали трансформантов на чашках, содержащих 50 мкг/мл канамицина. В результате трансформации на чашках ожидается формирование колоний двух типов: больших, выросших из клеток, трансформированных недорезанным или восстановленным в результате лигирования в клетках E. coli шаттл-вектором, и маленьких, вырастающих из клеток, в которых произошла рекомбинация между шаттл-вектором и плазмидой pAdEasy-1. Для оценки эффективности гомологичной рекомбинации в клетках штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 при использовании предложенного нами протокола был проведен подсчет колоний двух типов. При этом было установлено, что при проведении реакций трансформации с использованием четырех созданных нами шаттл-векторов на чашках выросло в среднем 144±31 большая колония и 89±27 маленьких колоний. По 10 маленьких колоний с каждой из чашек были проанализированы на предмет наличия корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды с помощью анализа электрофоретической подвижности суперскрученной плазмидной ДНК (рис. 1, а)

Таким образом, нами было установлено, что эффективность трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенным линеаризованным шаттл-вектором позволяет получить число маленьких колоний (890±270 в пересчете на 1 мкг линеаризованного шаттл-вектора), достаточное для идентификации корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Более того, нами было установлено, что химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 после года хранения при –80 °С сохраняют эффективность трансформации, достаточную для идентификации клонов, содержащих аденовирусную плазмиду с корректной рекомбинацией (данные не показаны).

Далее для проверки функциональности рекомбинантных плазмид получали аденовирусы в соответствии с опубликованным протоколом [3]. Проводили 3 раунда амплификации вирусных стоков, после чего инфицировали клетки HEK293 для проверки продукции соответствующих белков. На рис. 2 показаны

Таким образом, нами был предложен оптимизированный протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид на основе системы AdEasy, который не требует проведения электропорации и очистки линеаризованного шаттл-вектора. Нами было продемонстрировано эффективное получение рекомбинантных аденовирусных плазмид в результате трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1, приготовленных в лаборатории с помощью простой и доступной методики. Химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 сохраняют высокую эффективность трансформации на протяжении как минимум одного года, что позволяет быстро и эффективно создавать рекомбинантные аденовирусные плазмиды, используя единожды приготовленный запас компетентных клеток. Предложенный нами оптимизированный метод получения рекомбинантных адено-вирусных плазмид основан на использовании химически компетентных клеток, создание которых доступно для практически любой молекулярно-биологической лаборатории и не требует дорогостоящих реактивов, специальных навыков или оборудования. Кроме того, показанная нами эффективность трансформации компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, в отличие от ранее опубликованных протоколов [3, 5, 6], позволяет отказаться от проведения очистки из геля или переосаждения линеаризованного шаттл-вектора, что также существенно упрощает процедуру получения рекомбинантных плазмид. Оптимизированный нами про-токол подтверждает возможность отказа от проведения электропорации, что делает создание рекомбинантных аденовирусов более доступным для широкого круга пользователей за счет отсутствия необходимости использования оборудования и расходных материалов для электропорации или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток. Валидность предложенного нами подхода была подтверждена успешным получением функциональных аденовирусов, экспрессирующих соответствующие рекомбинантные белки в клетках HEK293.

В работе была использована инфраструктура Центра коллективного пользования Института биологии гена Российской академии наук «Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств».

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 16−04−00686 и № 16−04−00376).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Шепелев М.В. — e-mail: mshepelev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3639-3048

Коробко И.В. — e-mail: korobko1305@gmail.com

Автор, ответственный за переписку:

Шепелев М.В. — e-mail: mshepelev@mail.ru

Как цитировать:

Шепелев М.В., Коробко И.В. Оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид без использования электропорации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):-191. https://doi.org/10.17116/molgen201937041

Принятые сокращения:

т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов