Введение
Болезнь Паркинсона (БП) — одно из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, характеризующееся преимущественной гибелью дофаминергических нейронов в черной субстанции, которая приводит к дисбалансу медиаторов и последующей дезорганизации работы практически всех медиаторных систем мозга [1]. Для БП характерно хроническое, медленно прогрессирующее течение, а также длительный скрытый период развития заболевания.
Наличие семейных форм заболевания указывает на важную роль генетических факторов в развитии БП. На сегодняшний день выделяют 12 генов, мутации и нарушения в работе которых прочно ассоциированы с патогенезом БП [2]. Однако все известные на сегодняшний день мутации и полиморфизмы не описывают полный спектр патологических изменений, происходящих при БП.
В настоящее время не вызывает сомнений, что важную роль играют изменения на уровне транскриптома. Проведено большое количество работ в этом направлении в post-mortem тканях мозга и периферической крови пациентов с БП [3]. В результате этих работ, а также при анализе функций белков, кодируемых генами семейных форм БП, убедительно доказано изменение функционирования таких процессов, как убиквитин-зависимый протеолиз, функционирование митохондрий, синаптический транспорт и функционирование синапса при развитии нейродегенерации при БП [4].
Однако, несмотря на интенсивные исследования, молекулярно-генетические механизмы и гены, участвующие в развитии ранних стадий БП, остаются неизвестны и в целом картина этиопатогенеза этих этапов БП остается не до конца выясненной. В связи с этим необходимо продолжать поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания.
Стоит отметить, что большинство исследований по анализу экспрессионных профилей проводилось у пациентов с БП, находящихся на прогрессирующих или поздних стадиях БП. Выявляемые в этих случаях изменения экспрессии у пациентов на продвинутых стадиях БП могут быть связаны как с проводимой терапией, так и с наличием сопутствующих заболеваний у пациентов. В связи с этим необходимо проводить исследования у пациентов, как подвергавшихся, так и не подвергавшихся лечению и находящихся на самых ранних стадиях БП (1—2-я стадии по шкале Хена и Яра). Данные, полученные в результате такого анализа, могут способствовать уточнению картины этиопатогенеза заболевания, тогда как выявленные гены можно рассматривать в качестве биомаркеров нейродегенерации при БП.
Нами был проведен анализ изменения экспрессии генов CLN3, GABBR1 и WFS1, которые могут быть вовлечены в патогенез БП на уровне мРНК, у пациентов с БП, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, находящихся на ранних стадиях заболевания.
Методы
В настоящей работе было проанализировано 45 пациентов с недавно поставленным диагнозом «болезнь Паркинсона» (1—2-я стадии БП по шкале Хен и Яра), подвергавшихся и не подвергавшихся лечению. Для постановки диагноза пациенты были исследованы по международной унифицированной оценочной шкале БП (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS) и шкале Хена и Яра [5]. Для анализа были взяты только те пациенты, у которых отсутствовали наиболее частые мутации, ассоциированные с БП. Средний возраст ± стандартное отклонение пациентов составили 55,6±7,6 года. Соотношение полов составило примерно 1:1. Форма БП была преимущественно смешанной.
В качестве групп сравнения в настоящей работе исследовались следующие выборки: 23 пациента с различными неврологическими заболеваниями и 44 неврологически здоровых добровольца. Средний возраст ± стандартное отклонение в группе здорового контроля составили 26,0 11,9 года, а в группе неврологического контроля — 46,1±14,5 года. Подбор группы неврологического контроля осуществляли так, чтобы патогенез заболеваний у пациентов из этой группы, с одной стороны, сильно отличался от такового при БП, а с другой — был напрямую связан с центральной нервной системой и процессами нейродегенерации.
Все пациенты и неврологически здоровые добровольцы были отобраны в Научном центре неврологии, г. Москва. В группы отбирались лица славянского происхождения обоих полов. Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц. Исследование было одобрено Этическим комитетом ФГБУ «Научный центр неврологии» РАН.
Выделение РНК из крови
Для выделения тотальной РНК взятие образцов периферической крови осуществляли в 8 ч утра натощак, затем хранили до выделения не более 2 ч при +4 °С. Выделение тотальной РНК проводили из 200 мкл цельной крови с использованием набора ZR Whole-BloodTotal RNA Kit™ (Zymo Research Corp., США) согласно рекомендациям производителя. Концентрацию выделенной тотальной РНК измеряли с помощью набора Quant-iT RNA BR Assay Kit и флуориметра Qubit 3.0 (Invitrogen, США). Качество полученной РНК оценивали при помощи набора Experion™ RNA High Sens Analysis Kit и системы The Experion system (Bio-Rad, США). После выделения тотальную РНК разводили с тРНК дрожжей (100 нг/мкл) в пропорции 10:1 [6].
Анализ изменения относительных уровней мРНК генов-кандидатов
Анализ изменения относительных уровней мРНК генов проводили с использованием реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов.
Реакция обратной транскрипции
Реакция обратной транскрипции была проведена с использованием набора Revert Aid™ H Minus Reverse Transcriptase kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Для проведения реакции использовались обратные праймеры, последовательности которых приведены в табл. 1. Реакция проводилась на амплификаторе T3 Thermocycler (T3 Thermoblock, Biometra, Германия).
Постановка ПЦР в реальном времени с использованием системы TaqMan
При проведении ПЦР в реальном времени в качестве матрицы использовали кДНК, полученные в ходе реакции обратной транскрипции, разведеннные в растворе тРНКE.coli (100 нг/мкл). ПЦР в реальном времени проводили на приборах StepOnePlus™ System (AppliedBiosystems, США) с использованием реагентов для ПЦР (Синтол, Россия). Для проведения амплификации использован следующий температурный режим: 50 °C — 60 с, 95 °C — 600 с, далее 40 циклов 95 °C — 20 с и 61 °C — 50 с.
Каждый образец был проанализирован трижды для коррекции различий в качестве образцов и эффективности реакции обратной транскрипции.
Статистическая обработка и биоинформатический анализ данных
Подбор праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени с использованием системы TaqMan
Праймеры и зонды для проведения реакции ПЦР в реальном времени были подобраны с помощью программы Beacon Designer 7.0 Premier Biosoft International (PaloAlto, США) и нуклеотидных последовательностей генов CLN3, GABBR1, WFS1, а также генов домашнего хозяйства POLR2F и PSMA5 (последовательности ген-специфичных праймеров и зондов представлены в табл. 1).
Примечание. * — инвентарные номера (Accession numbers) в базе данныхGenBank (NCBI-GenBank Release 229.0). FAMи VIC — флуоресцентные красители, BHQ1и BHQ2 — тушители флуоресценции. Курсивом выделены праймеры, использованные для проведения реакции обратной транскрипции.
Расчет относительных уровней экспрессии проводили с использованием метода сравнения пороговых уровней амплификации ΔΔCt [7]. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica for Windows 8.0 («Stat Soft, Inc.», 2007) и программного обеспечения MS Excel 2013 («Microsoft»). Для оценки относительных уровней экспрессии генов применяли непараметрический U-тест Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Был проведен анализ изменения относительных уровней мРНК генов CLN3, GABBR1 иWFS1 в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся и не подвергавшихся лечению, и в группах сравнения. Отбор генов для исследования был осуществлен на основании различных данных об их возможном вовлечении в патогенез БП. Гены CLN3 и GABBR1 были отобраны главным образом исходя из того, что они были выявлены при полнотранскриптомном анализе периферической крови пациентов со спорадической формой БП [8]. Ген WFS1 был отобран на основании данных, полученных в лаборатории ранее. Так, на российской выборке пациентов со спорадической формой БП было показано, что наличие аллеля T по полиморфизму rs1801211 в этом гене повышает риск развития БП в 2,34 раза [9].
Результаты приведены в табл. 2. Как видно из табл. 2, ни для одного гена не было показано статистически значимых изменений уровня мРНК у пациентов с БП относительно контроля. Также не было показано достоверных изменений относительных уровней мРНК в группе неврологического контроля.
Примечание. 1 — медиана, 2 — 25—75 процентили. Значения с p<0,05 выделены жирным шрифтом. Уровень экспрессии в контроле принят за единицу.
Белок CLN3 локализуется преимущественно в мембранах комплекса Гольджи, лизосом и эндосом. Функции белка до конца не изучены, однако предполагается его вовлечение в процессы регуляции функционирования лизосом, транспорта малых молекул иаутофагии [10—13]. В недавнем исследовании впервые описан гетерозиготный носитель мутации в гене CLN3 с симптомами поражения экстрапирамидной системы [14], не связанными напрямую с БП. В нашем исследовании мы также не выявили достоверных изменений уровня мРНК этого гена у пациентов с БП, что, возможно, указывает на то, что ген CLN3не играет существенной роли в патогенезе данного заболевания.
Ген GABBR1 кодирует субъединицу метаботропного ГАМК(B) рецептора, связанного с калиевым каналом через G-белок. ГАМК(B) рецепторы состоят из двух субъединиц (GABBR1 и GABBR2) и действуют как ингибиторы кальциевых каналов на пресинаптической мембране и как активаторы калиевых каналов на постсинаптической мембране [15, 16]. При моделировании БП с использованием МФТП и 6-ГДА было показано изменение в работе ГАМК(B) рецепторов [17], а также выявлена необходимость ГАМКергического торможения при дофаминовой депривации [18]. Также недавний метаанализ полногеномных данных микрочипов, полученных при исследовании различных тканей мозга людей, показал, что при БП и при болезни Альцгеймера наблюдается снижение экспрессии гена GABBR1 [19]. Однако в нашей работе достоверных изменений относительного уровня мРНК для этого гена в периферической крови пациентов с БП показано не было. Необходимо отметить, что приведенные выше исследования проводились на токсических моделях более поздних стадий БП, а при метаанализе использовались данные, полученные при исследовании post-mortem тканей мозга пациентов с БП. Таким образом, отсутствие изменений экспрессии гена GABBR1 в нашей работе может быть связано с тем, что изменение представленности транскрипта данного гена еще не наблюдается на ранних клинических стадиях БП, а проявляется лишь позже.
Ген WFS1 кодирует вольфрамин, трансмембранный белок, локализующийся преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [20]. Известные функции вольфрамина включают в себя регуляцию концентрации ионов кальция в ЭПРи ответ на стресс ЭПР [21—23]. Было показано, что нокдаун данного гена повышает восприимчивость к нейродегенерации [24]. При моделировании БП было выявлено существенное снижение экспрессии гена WFS1 [25], однако достоверных изменений относительного уровня мРНК этого гена при анализе пациентов с БП в нашей работе выявлено не было. Подобные различия могут быть связаны с тем, изучалась модель развернутой симптомной стадии БП, тогда как на ранних этапах развития данной патологии изменение экспрессии гена WFS1, скорее всего, еще не вовлечено в патогенез этого заболевания.
Заключение
Все известные функции продуктов исследуемых генов, а также выявленные ассоциации этих генов с различными неврологическими заболеваниями указывают на их возможное вовлечение в патогенез БП. Однако данные, представленные в настоящей работе, позволяют предполагать, что исследуемые гены — CLN3, GABBR1 и WFS1 — не вносят вклад в патогенез заболевания на уровне мРНК у пациентов с БП на ранних симптомных стадиях, и, следовательно, не могут рассматриваться в качестве биомаркеров ранних стадий БП.
Финансирование. Работа была поддержана РНФ (№17-75-10119). Работа была выполнена с использованием приборов ЦКГТ ИМГ РАН.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.