Лактобактерии являются основным компонентом здоровой микробиоты влагалища, составляя до 97% от общего количества микроорганизмов. Они обеспечивают защиту организма хозяина и способствуют созданию здоровой вагинальной среды, продуцируя молочную кислоту, перекись водорода и бактериоцины, что препятствует колонизации влагалища патогенными микроорганизмами [1]. Также известно, что лактобактерии усиливают барьерную функцию эпителиальных клеток и стимулируют врожденный иммунитет хозяина [2]. Наибольшее распространение в микробиоте здоровых женщин имеют 4 вида лактобактерий: Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus iners и Lactobacillus gasseri [3, 4]. Снижение количества лактобактерий свидетельствует о нарушении равновесного состояния вагинального микробиоценоза и может привести к колонизации влагалища потенциально патогенными бактериями и микроскопическими грибами, что сопровождается развитием бактериального вагиноза, аэробного вагинита или инфекций, передаваемых половым путем [1]. Дисбиоз влагалищной среды связывают с такими важными неблагоприятными состояниями в жизнедеятельности женщин, как преждевременные роды, воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие [5].

Развитие дисбиозов влагалища, по-видимому, может иметь различную этиологию, включая спринцевание, применение спермицидов, прием антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, инфекции и др. [1]. Одну из причин нестабильности лактобактерий в вагинальном микробиоме связывали с зависимостью колонизации влагалища лактобактериями от эстроген-зависимой продукции гликогена клетками вагинального эпителия [6]. Однако эта гипотеза не поддерживается тем фактом, что не все виды вагинальных лактобактерий способны напрямую усваивать гликоген [7]. Более того, геном L. Crispatus — вида, ассоциированного с нормоценозом, — не содержит генов для расщепления гликогена [8, 9]. Таким образом, вопрос о механизмах нестабильности видов Lactobacillus во влагалищной популяции остается дискуссионным.

Бактериофаги являются важными членами микробных сообществ, и, безусловно, могут оказывать серьезное влияние на их состав и структуру. Описано достаточно много бактериофагов лактобактерий, однако основные усилия научного сообщества направлены на выделение и изучение фагов, специфичных для лактобактерий, выделенных из пищевых продуктов, кишечника человека и сточных вод [10]. Фаги вагинальных лактобактерий на данный момент изучены слабо, хотя сообщение о том, что вагинальные лактобактерии содержат профаги, способные к индукции, появилось более 20 лет назад [11]. Описанные фаги различались как по морфологическим характеристикам, так и по специфичности к штаммам хозяев. Также было показано, что фаги, полученные из лактобактерий влагалища одной женщины, могут инфицировать лактобактерии, выделенные из влагалища других женщин. Позднее той же группой исследователей было показано присутствие способных к спонтанной индукции фагов у L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii, L. fermentum, L. vaginalis, выделенных из влагалища женщин из США и Турции [12]. На основании данных электронной микроскопии выделенные фаги были разделены на 4 морфотипа. Результаты гибридизации с мечеными зондами показали, что изоляты внутри каждого морфотипа могут различаться генетически [12]. Один из фагов L. gasseri, KC5a, впоследствии был секвенирован. Для штаммов L. gasseri, выделенных как из кишечника, так и из влагалища, были охарактеризованы и полностью секвенированы также фаги: phiadh, jlb1 и LgaI [13—15].

R. Martin и соавт. [16], изучая 45 штаммов вагинальных лактобактерий, принадлежащих видам L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri, выявили профаговые последовательности у около половины штаммов, хотя многие из этих профагов индуцировать не удалось. В одном случае индуцированная в штамме L. jensenii бактерицидная активность сопровождалась продуцированием бактериофага, который получил обозначение Lv-1 и был идентифицирован как член семейства Siphoviridae [16]. Позднее эндогенные фаговые частицы наблюдали у 10 из 13 штаммов L. crispatus и у 4 из 14 штаммов L. jensenii, выделенных из вагинальных мазков [17]. Наличие профагов у L. crispatus подтверждается биоинформатическими данными. В геномах 10 штаммов L. crispatus были идентифицированы кластеры характерных фаговых генов [8]. В 8 штаммах L. crispatus в результате полногеномного секвенирования было выявлено от 1 до 6 копий характерного для бактериофагов гена лизина. После индукции митомицином наблюдали лизис клеток и увеличение количества копий гена лизина в 30—50 раз, что свидетельствует о наличии способных к репликации профагов в геномах проанализированных штаммов [18].

Несмотря на неоспоримые доказательства широкого распространения профагов в геномах вагинальных лактобактерий, наши знания об их видовом разнообразии находятся на начальном уровне. В базе данных нуклеотидных последовательностей имеются сведения только для 1 бактериофага L. jensenii и 4 бактериофагов L. gasseri. Среди видов лактобактерий, для которых описаны примеры фаговой лизогении, отсутствует один из ключевых видов вагинального микробиома — L. iners, а видовая специфичность описанных фагов других лактобактерий остается неизученной. Ждут своего изучения и механизмы индуцированной или спонтанной репродукции фагов, а также их возможное влияние на стабильность лактобактерий в вагинальном микробиоценозе.

Цель работы — выявление и определение генетического разнообразия потенциально активных умеренных бактериофагов в геномах основных вагинальных видов лактобактерий на основании геномных и метагеномных данных.

Материал и методы

Для оценки возможного присутствия профаговых последовательностей в геномах лактобактерий было проанализировано 129 геномных сборок бактерий видов L. crispatus, L. jensenii, L. iners и L. gasseri, доступные в базе NCBI Nucleotide на октябрь 2018 г.

Для оценки представленности профагов в вирусных метагеномах были проанализированы 4 доступных в базе NCBI SRA вирусных WGS-метагенома влагалища от пациентки с бактериальным вагинозом. Идентификаторы метагеномов: SRR6354890, SRR6354891, SRR6354892 и SRR6354893 (BioProject PRJNA421203).

Определение профаговых участков. Поиск профаговых участков проводили с помощью программ PHASTER и Phigaro [19] (https://paperpile.com/c/MDTTG2/Nmcs). Программа PHASTER производит поиск областей с наибольшей плотностью фаговых генов на основании соответствия открытых рамок считывания в обновляемой базе фаговых последовательностей. Программа Phigaro использует аналогичный подход, предсказывая фагоподобные гены с использованием профилей скрытых марковских моделей (HMM) ортологичных вирусных генов pVOG [20]. Профаговые области определяются методом треугольного окна как области с высокой плотностью фагоподобных генов, в которых встречаются структурные гены бактериофагов (такие, как ген капсида и др.). При определении профаговых областей также учитывается GC-состав таких участков.

После первичного скрининга фаговых генов в дальнейшем анализе учитывали лишь те последовательности, которые были идентифицированы двумя программами как предположительные профаги. Для получения неизбыточного списка предположительных профагов предсказанные последовательности кластеризовали в программе CD-HIT [21].

Анализ сходства с геномами известных фагов лактобактерий. Сходство с последовательностями известных бактериофагов лактобактерий оценивали путем выравнивания идентифицированных последовательностей вероятных профагов на геномы фагов Lv-1 (NC_011801.1), phiadh (NC_000896.1), jlb1 (NC_024206.1) и KC5a (NC_007924.1) с помощью программы blastn для командной строки (task: blastn).

Анализ вирусных метагеномов. Картирование 4 доступных виромов влагалища на базу из полученных нами последовательностей профагов проводили с помощью программы bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml). Для каждого рида допускалось только одно картирование (параметр -k 1). Картирование производили с использованием настроек «sensitive-local».

Результаты и обсуждение

Идентификация профаговых последовательностей. При анализе 129 геномных сборок лактобактерий с помощью программы PHASTER нами было получено 18, 29, 10 и 9 «полных» («intact», согласно классификации PHASTER) последовательностей предположительных профагов в геномах L. jensenii, L. gasseri, L. crispatus и L. iners соответственно. Данные последовательности были также предсказаны программой Phigaro. «Неполные» («incomplete» и «questionable», согласно классификации PHASTER) последовательности в дальнейшем анализе не учитывались.

Для получения неизбыточного списка предположительных профагов была проведена кластеризация выявленных последовательностей. Использовались геномные координаты, полученные программой PHASTER. Кластеризация проводилась при порогах идентичности от 40 до 100% с шагом 5% (рис. 1).

Анализ числа кластеров последовательностей, полученных при использовании различных порогов идентичности, не позволил выявить однозначного порога идентичности для проведения кластеризации. Однако, как видно на рис. 1, начиная со значений идентичности 80—85% кривая выходит на плато. При выравнивании последовательностей из кластеров, полученных при порогах идентичности 80, 85, 90, 95 и 100%, с использованием программы Clustal Omega, было установлено, что некоторые более короткие последовательности являются полностью идентичными участкам более длинных последовательностей. Такие короткие подпоследовательности были исключены из дальнейшего анализа. В результате был получен неизбыточный список из 51 последовательности предположительных профагов.

Распределение предположительных профаговых последовательностей по видам лактобактерий было следующее: 12 профагов было найдено в 9 из 18 проанализированных геномов L. jensenii, 23 профага — в 17 из 34 проанализированных геномов L. gasseri, 9 профагов — в 8 из 56 проанализированных геномов L. crispatus и 7 профагов — в 7 из 21 проанализированных геномов L. iners.

Выявленные предположительно профаговые последовательности были обозначены phiLjen1-phiLjen12, phiLgas1-phiLgas23, phiLcri1-phiLcri9 и phiLine1-phiLine7 для геномов L. jensenii, L. gasseri, L. crispatus и L. iners, соответственно (табл. 1).

Примечание. * A1 и B1 — морфотипы фагов лактобактерий в работе [12].

Пример геномной структуры одной из последовательностей предположительных профагов приведен на рис. 2.

Соответствие предположительных профаговых последовательностей описанным ранее профагам. Выявленные предположительные профаговые последовательности сравнили с известными последовательностями фагов вагинальных лактобактерий (см. табл. 1). Предположительные профаговые участки, идентифицированные в геномах L. jensenii штаммов SNUV360, IM18-3, SJ-7A-US, показали частичное сходство с фагом Lv-1, который также ведет свое происхождение из штамма L. jensenii [16]. В последовательностях данных профагов были обнаружены участки длиной от 18 до 24 т.п.н., имевшие высокую степень идентичности (более 90%) соответствующим фрагментам генома фага Lv-1. Другие 9 последовательностей предположительных профагов, выявленных в геномах L. jensenii, не показали сходства с известными фагами вагинальных видов лактобактерий.

Профаг, выявленный в геноме L. gasseri штамма ATCC 33323, соответствовал описанному ранее в этом штамме спонтанно индуцирующемуся профагу LgaI [15] и представлял собой две тандемно расположенных последовательности профага, что согласуется с известными данными о расположении профага LgaI в штамме ATCC 33323 в виде двух тандемных копий [13]. Частичное сходство с фагом jlb1 показали предположительные профаговые последовательности, выявленные у штаммов L. gasseri PSS7772D, UMB0099, ATCC 33323 и JV-V03. В последовательностях данных профагов были обнаружены участки длиной от 12 до 23 т.п.н., имевшие высокую степень идентичности (более 90%) соответствующим фрагментам генома фага jlb1.

Предположительные профаговые последовательности в штаммах L. gasseri UMB0056 и 987_LJOH показали частичное сходство с фагом KC5a, в штамме 497_LGAS — с фагом phiadh. Прочие последовательности предположительных профагов, выявленные в геномах L. gasseri, не показали сходства с известными фагами.

Профаговые последовательности, выявленные в геномах L. crispatus и L. iners, не имели сходства с фагами L. jensenii и L. gasseri или другими описанными ранее фагами лактобактерий.

A. Kilic и соавт. [12] выделили 67 фагов L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii и определили их некоторые функциональные, морфологические и генетические свойства. Авторы разделили описанные фаги на 4 морфотипа и дифференцировали их методом ПЦР. Мы использовали описанные этими авторами последовательности праймеров для n silico анализа соответствия между выявленными нами последовательностями предположительных профагов и морфотипами, описанными в их работе. Выравнивание последовательностей праймеров на полученные нами профаговые последовательности показало полное совпадение либо высокую степень сходства праймеров для морфотипа А1 с профаговыми последовательностями 6 штаммов L. gasseri и праймеров для морфотипа В1 с профаговыми последовательностями 3 штаммов L. jensenii (см. табл. 1). Соответствия праймеров для морфотипов А2 и В2 профаговым последовательностям, идентифицированным в настоящем исследовании, выявлено не было.

Таким образом, 4 последовательности предсказанных профагов L. jensenii и 9 последовательностей предсказанных профагов L. gasseri имеют сходство с ранее описанными типами фагов. Вместе с тем 8 и 14 последовательностей предсказанных профагов L. jensenii и L. gasseri соответственно и все последовательности предсказанных профагов L. crispatus и L. iners аналогов не имели. Следует также отметить, что некоторые штаммы содержали по несколько разных профагов.

Возможное присутствие предсказанных профагов в вирусных метагеномах влагалища. Для выявления возможного присутствия предсказанных нами последовательностей предположительных профагов в вирусных метагеномах (виромах) реальных людей мы провели картирование ридов, полученных при метагеномном секвенировании секрета влагалища от пациентки с бактериальным вагинозом, получавшей курс антибиотиков (см. Материал и методы), на последовательности предположительных профагов, выявленных в настоящем исследовании. В результате картирования 26 профаговых последовательностей из 51 были покрыты хотя бы 10 ридами. Всего на группу профаговых последовательностей картировалось от 0,38% до 1,10% ридов для каждого из образцов (табл. 2). Наибольшая доля ридов картировалась в образце, полученном до терапии клиндамицином (табл. 3). Наибольшую степень покрытия ридами вирусных метагеномов показали последовательности предположительных профагов L. iners phiLin1, phiLin2, phiLin5, phiLin6, L. jensenii phiLjen10 и L. crispatus phiLcri8.

Предположение о возможной роли бактериофагов в снижении численности лактобактерий в вагинальной микробиоте было высказано достаточно давно [11, 12], однако внимание к бактериофагам вагинальных лактобактерий как потенциальному триггеру развития вагинального дисбиоза ограничивается несколькими работами. К настоящему времени только 1 фаг L. jensenii и 4 фага L. gasseri были выделены, охарактеризованы и секвенированы [12—15]. В настоящей работе мы, используя средства биоинформатики, исследовали распространенность и генетическое разнообразие фагов в геномах лактобактерий, которые наиболее часто доминируют в вагинальной микробиоте женщин. Анализ 129 геномных сборок бактерий видов L. crispatus, L. jensenii, L. iners и L. gasseri, доступных в базе NCBI Nucleotide на октябрь 2018 г., показал, что по крайней мере половина штаммов содержат предположительные профаговые последовательности, при этом в некоторых штаммах может быть несколько разных профагов. Биоинформатический анализ выявил известные профаги LgaI и jlb-1, ранее описанные для L. gasseri, а также ряд профагов, имеющих мозаичное сходство с геномами известных бактериофагов L. gasseri и L. jensenii (см. табл. 1). Так, в составе описанных в настоящем исследовании последовательностей обнаруживались фрагменты размером от 12 до 23 т.п.н., имеющие высокую степень сходства с известными фагами Lv-1, jlb-1 и KC5a. Мозаичность геномной архитектуры была показана для большого числа бактериофагов [22] и является следствием рекомбинации. Описанные в настоящем исследовании предположительные профаговые последовательности имели мозаичное сходство с известными фагами тех же видов бактерий-хозяев, что может говорить о некогда происходившей рекомбинации вирусов.

Обнаруженное разнообразие профаговых последовательностей не ограничивалось видами, известными к настоящему времени, и помимо известных фагов были выявлены последовательности, не имевшие аналогов в базе NCBI Nucleotide. Уникальные профаговые последовательности были выявлены в геномах всех основных видов вагинальных лактобактерий: L. jensenii, L. gasseri, L. crispatus, L. iners. В отношении последнего вида доказательства существования профагов у L. iners представлены впервые.

Интересно, что выявленные профаговые последовательности были специфичны для каждого вида, т.е. не встречались у других видов лактобактерий. Это плохо соотносится с наблюдением, что профаги, индуцированные в одних видах вагинальных лактобактерий, могли инфицировать другие виды [12]. Для разрешения этого противоречия мы высказываем предположение, что фаговая инфекция только специфичного хозяина приводит к лизогении, т.е. к встраиванию генома фага в геном бактерии-хозяина, тогда как инфекция неспецифичного хозяина может приводить только к литической инфекции. Однако о механизмах фаговой инфекции вагинальных лактобактерий и факторах, определяющих ее специфичность, практически ничего не известно, поэтому выдвинутое предположение нуждается в экспериментальной проверке.

Обнаружение предсказанных профаговых последовательностей в вирусных метагеномах влагалища свидетельствует, что предсказанные профаги могут встречаться в реальном вагинальном микробиоме женщины с бактериальным вагинозом.

Биоинформатический анализ не позволяет определить, представляют ли выявленные профаговые последовательности функционально активные фаги, которые могут вызывать литическую инфекцию, но тот факт, что некоторые из выявленных профагов соответствуют известным биологически активным профагам, позволяет предполагать, что и другие выявленные профаговые последовательности тоже могут представлять функционально активные профаги. Проверка этого предположения является предметом продолжающихся исследований.

Заключение

Биоразнообразие бактериофагов основных видов вагинальных лактобактерий не исчерпывается описанными до сих пор видами бактериофагов L. jensenii и L. gasseri. Все 4 основных вида вагинальных лактобактерий, L. jensenii,L. gasseri, L. crispatus и L. Iners, содержат в своих геномах профаговые последовательности различной специфичности. Свидетельства существования профагов у L. iners представлены впервые. Последующие исследования позволят понять роль бактериофагов во взаимоотношениях между различными видами лактобактерий в вагинальном микробиоценозе.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 19-015-00385).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.