ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Подбор условий рефолдинга рекомбинантных белков, склонных к агрегации и образующих тельца включения при экспрессии в Escherichia coli, на примере двух гомологов CRISPR-эффекторов Cas12m.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Гены Cas12m амплифицировали и клонировали в экспрессионные векторы с N-концевым His-тегом. Полученные плазмиды трансформировали в E.coli. Экспрессию индуцировали IPTG, после чего белки, накопленные в тельцах включения, солюбилизировали в хаотропном агенте и очищали методом аффинной металл-хелатной хроматографии на Ni-TED-колонке с одновременным рефолдингом на колонке с использованием метода двух градиентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Был проведен комплексный подбор условий экспрессии, однако во всех тестируемых штаммах белки образовывали тельца включения. Оптимизация условий индукции, а также использование различных слитых белков не дало заметного результата. Для решения проблемы низкой растворимости был разработан протокол рефолдинга с иммобилизацией денатурированного белка на Ni-TED смоле, который показал наибольшую эффективность по сравнению с традиционными методами. Ключевым аспектом стало применение системы двух градиентов — одновременное снижение концентрации денатуранта и повышение концентрации детергента. В результате удалось получить целевые белки в растворимой форме. Несмотря на потери белка из-за частичной агрегации и наличие примесных белков, характерных для металл-хелатной хроматографии, полученные препараты обладают достаточной чистотой для последующих исследований функциональной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенный метод превосходит традиционные способы рефолдинга диализом или разведением по воспроизводимости и выходу растворимого белка. Представленный подход может быть распространен на широкий круг агрегационно-нестабильных белков и рассматривается как одна из стратегий для получения труднорастворимых белков в растворимой форме.