Автор:

Бактериологические посевы

Лабораторная оценка состояния вагинальной микробиоты – обязательная часть гинекологического осмотра не только при подозрении на наличие инфекционно-воспалительных заболеваний репродуктивного тракта, но и при плановом профилактическом обследовании здоровых женщин [1].

Для выявления этиологически значимого инфекционного патогена акушеру-гинекологу доступны разнообразные лабораторные тесты, включающие определение pH влагалищной среды, микроскопию влагалищного отделяемого, бактериологическое исследование, молекулярно-биологические тесты [1, 2]. При этом одной из самых ранних методик лабораторной диагностики в гинекологической практике считается культивирование биологического материала, то есть посевы на питательные среды различных образцов биоматериала, взятого у пациентки (влагалищные выделения, гной и т. д.), и выделение чистой культуры возбудителя с определением чувствительности к антибиотикам [3]. Несмотря на существенное расширение представлений о видовом составе влагалищной микробиоты и появление современных тестов, основанных на обнаружении ДНК или РНК возбудителей с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или изотермической амплификации нуклеиновых кислот (NASBA, nucleic acid sequence-based amplification) соответственно, в акушерстве и гинекологии остается все также востребованной традиционная практика «бактериологических посевов». Однако неуместное использование методики и неверная интерпретация результатов несут в себе неочевидные, на первый взгляд, риски не только для здоровья отдельной пациентки, но и для общества в целом.

Общеизвестно, что диагностические тесты обладают различной чувствительностью и специфичностью в отношении конкретных возбудителей инфекций женского репродуктивного тракта, которые в практической гинекологии условно делятся на инфекции нижних отделов генитального тракта и воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) [4]. Какую же роль в разработке терапевтической стратегии при инфекционно-воспалительных заболеваниях нижних и верхних отделов женской репродуктивной системы играют бактериологические посевы?

ВЗОМТ в зависимости от вовлечения в воспалительный процесс различных органов верхних отделов женского генитального тракта, включают целый ряд топических диагнозов, таких как эндометрит, сальпингит, оофорит, параметрит, тубоовариальный абсцесс и/или тазовый перитонит, а также их разнообразные комбинации [5–8]. Половина случаев ВЗОМТ связана с возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), – Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium – и анаэробами, участвующими в развитии бактериального вагиноза (БВ) [5–10]. В исследовании было установлено, что у женщин с лапароскопически подтвержденными ВЗОМТ частота трубного бесплодия была более чем в два раза ниже среди тех, кто начал лечение в первые три дня с момента появления симптомов, по сравнению с приступившими к терапии позже (8,3% против 19,7%) [11]. В этой связи диагностика ВЗОМТ основывается на стратегии «низкого диагностического порога», под которой понимают быструю верификацию ВЗОМТ, опираясь на анамнестические и клинические признаки (появление нового полового партнера в предшествующие 3–6 месяцев, боли внизу живота, ациклические кровотечения из половых путей, лихорадка, гнойные выделения и некоторые другие) и – в меньшей степени – на лабораторные данные (например, на повышение С-реактивного белка) [5–8]. Принимая во внимание серьезные последствия отсроченного лечения, антибактериальная терапия ВЗОМТ в подавляющем большинстве случаев назначается эмпирически на основании клинических критериев и включает одновременное использование регламентированных клиническими протоколами трех групп антибактериальных препаратов, перекрывающих спектр возможных этиологических агентов ВЗОМТ [5–8].

Поиск этиологических патогенов при развитии ВЗОМТ необходим прежде всего для последующей оценки эффективности проведенной антибактериальной терапии и исключения ИППП у партнера (партнеров) для предотвращения реинфицирования [5, 6]. Для этих целей до начала антибактериальной терапии производят pH-метрию влагалищной среды для исключения бактериального вагиноза, забор материала из влагалища для выявления ДНК Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium методом ПЦР и анаэробов, ассоциированных с бактериальным вагинозом, реже используют бактериологические посевы для диагностики хламидийной и гонорейной инфекций [6–8]. Другими словами, выбор антибактериальных препаратов для эмпирической терапии при подозрении на ВЗОМТ не зависит от лабораторной составляющей диагностики, в том числе и от результатов бактериологических посевов. Для рутинного выделения более редких возбудителей ВЗОМТ с помощью культуральных методик (например, Actinomyces) в доступе акушера-гинеколога женской консультации, стационара или частного центра специальные лабораторные тесты отсутствуют, хотя являются необходимыми в соответствии с клиническими протоколами Минздрава России [8].

Какую нишу культуральные методы занимают в диагностике и лечении инфекций нижних отделов репродуктивного тракта, к которым относятся бактериальный вагиноз, аэробный вагинит, кандидозный вульвовагинит, а также ИППП, включающие хламидиоз, трихомониаз, гонорею и инфекцию, вызванную Mycoplasma genitalium?

К наиболее распространенным влагалищным инфекциям, этиологически связанным с условно-патогенными микроорганизмами и сопровождающимся патологическими влагалищными выделениями, относят бактериальный вагиноз, аэробный вагинит и кандидозный вульвовагинит [5, 12, 13].

Бактериальный вагиноз (БВ) – невоспалительный синдром, характеризующийся дисбалансом вагинальной микробиоты, проявляющимся снижением количества лактобактерий и увеличением количества облигатных и факультативных анаэробных условно-патогенных микроорганизмов.

Кандидозный вульвовагинит (КВВ) – воспаление влагалища и вульвы, вызванное грибами рода Candida.

Аэробный вагинит (АВ) – воспаление слизистой оболочки влагалища, вызванное нарушением микробиоценоза влагалища вследствие воздействия аэробных микроорганизмов: Streptococcus agalactiae, S. aureus, E. coli.

Для установления диагностической значимости бактериологических посевов для женщин с БВ, КВВ и АВ рассмотрим проект клинических рекомендаций «Воспалительные болезни шейки матки, влагалища и вульвы» (2021) [14], а также европейские рекомендации IUSTI (2018) [12] и американский протокол CDC (2021) [5].

Патогенез БВ неразрывно связан с биопленками, сформированными Gardnerella vaginalis и целым рядом других анаэробных БВ-ассоциированных микроорганизмов, к которым относят Atopobium vaginae, BVAB1 (Bacterial Vaginosis Associated Bacteria), BVAB2, BVAB3, Megasphaera type 1, Megasphaera type 2, Mycoplasma hominis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Eggerthella spp., Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens, Peptostreptococcus spp., Prevotella buccalis-like, Prevotella spp. [13, 15]. Рутинная диагностика БВ основана на использовании клинико-лабораторных критериев Amsel (гомогенные беловато-серые выделения из половых путей с запахом рыбы; повышение pH влагалищных выделений выше 4,5; положительный аминотест; выявление «ключевых» клеток при микроскопии влагалищных выделений), реже – критериев Nugent или количественной ПЦР [5, 12, 13, 16]. Отдельная изоляция строгих БВ-ассоциированных анаэробов является крайне трудоемким, дорогостоящим, недоступным диагностическим тестом [17]. Принимая во внимание тот факт, что для лечения БВ используют антибактериальные препараты только из двух групп – 5-нитроимидазол (метронидазол, тинидазол и другие) и клиндамицин [5, 12, 13, 16], определение чувствительности к антибиотикам нецелесообразно. Важно подчеркнуть, что попытки подтверждения БВ на основании обнаружения роста Gardnerella vaginalis на питательных средах ненадежны, так как Gardnerella vaginalis достаточно часто встречается у абсолютно здоровых женщин фертильного возраста [18].

Диагностика КВВ включает в себя наличие клинических симптомов (патологические выделения, отечность, зуд, дизурия, покраснение и другие) в сочетании с обнаружением элементов грибов при микроскопии нативного или окрашенного мазка вагинального отделяемого. Культуральное исследование с видовой идентификацией грибов рода Candida и определением чувствительности к антимикотикам при КВВ используется при рецидивирующем течении заболевания (более 4 эпизодов в течение одного года), при рефрактерности к стандартной терапии [5, 12]. Однако результаты культурального исследования нуждаются в осторожной интерпретации, поскольку, во-первых, обнаружение роста грибов на питательных средах без клинических проявлений не позволяет поставить диагноз «кандидозный вульвовагинит» [5, 12], во-вторых, данные по чувствительности дрожжеподобных грибов к противогрибковым препаратам in vitro и в естественной среде могут существенно различаться [19]. Таким образом, микробиологическое исследование применяется при хроническом КВВ, но имеет некоторые ограничения по специфичности результатов и трактовке данных по резистентности к антимикотикам.

Диагноз «аэробный вагинит» в соответствии с оригинальными исследованиями [20] и рекомендациями IUSTI (2018) [12] верифицируется на основании отдельных параметров нативной микроскопии. Бактериологическое исследование при подозрении на АВ, по мнению экспертов IUSTI, обладает недостаточной специфичностью, так как возбудители АВ, к которым относят Streptococcus agalactiae, S. aureus, E. coli, встречаются у большинства клинически здоровых женщин и не могут рассматриваться как специфичные бактерии, характерные сугубо для АВ. Указанное означает, что культуральные методы не рекомендуются для постановки диагноза «аэробный вагинит», но могут быть полезны данные для определения антибиотикочувствительности выявленных условно-патогенных бактерий для оптимизации противомикробной терапии при рецидивирующем течении АВ [12, 14].

Культуральная диагностика, применяемая для выявления возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis), в том числе при ВЗОМТ, также с течением времени несколько утратила свою актуальность в отдельных аспектах.

«Золотым стандартом» подтверждения хламидийной инфекции является обнаружение ДНК/РНК C. trachomatis в цервико-вагинальном отделяемом [5, 9]. Для этих целей не применяются серологические методы (определение антитела в плазме крови) диагностики или же методы прямой иммунофлюоресценции. Бактериологические посевы сегодня используются крайне редко, преимущественно в научных референс-лабораториях для мониторинга чувствительности к антибактериальным препаратам и изучения факторов вирулентности в динамике, а также при необходимости подтверждения сексуального насилия в судебно-медицинской практике [21]. Посевы образцов материала осуществляются на клеточные линии почек Mc Coy, HeLa 229 или Buffalo Green Monkey Kidney. Выделением живых штаммов C. trachomatis занимаются опытные в данном вопросе эксперты. Чувствительность культур может быть снижена из-за нарушений правил забора материала, хранения и транспортировки образцов, наличия «мешающих факторов» в образцах и чрезмерного роста клеточных культур иных условно-патогенных влагалищных микробов. Указанное дополняют существенная продолжительность выполнения бактериологического посева, трудоемкость и сложности стандартизации. В этой связи в соответствии с российскими и зарубежными клиническими протоколами микробиологическое (культуральное) исследование для выделения C. trachomatis в рутинной практике не рекомендуется [5, 9, 21].

Напротив, использование культурального исследования в диагностике трихомониаза отчасти сохранило свою значимость для клинической практики гинекологов и дерматовенерологов. В отличие от низкочувствительной микроскопии, культуральное исследование для изоляции T. vaginalis имеет высокую чувствительность, в частности стандартизованные питательные среды для культивирования T. vaginalis (InPouch TV; BioMed Diagnostics), но, к сожалению, повсеместно недоступно [12]. В соответствии с клиническим протоколом CDC [5] бактериологический посев с использованием системы InPouch (BioMed Diagnostics) считался наиболее чувствительным методом выделения колоний T. vaginalis до того, как были валидированы и внедрены в клиническую практику методы ПЦР. Культуральный метод обладает чувствительностью 44–75% и специфичностью <100%, но требует постоянного контроля [5]. Согласно российским рекомендациям, выделение T. vaginalis [22] с помощью бактериологического метода целесообразно в когорте пациенток с субклиническими (стертыми) формами инфекции, а также при отрицательных результатах микроскопии, но при наличии патогномоничных симптомов, в частности «клубничной шейки». И хотя чувствительность бактериологического исследования при трихомониазе достаточно высока (95%), но оно требует больших трудовых и временных затрат в сравнении с ПЦР. Действительно, самой высокой чувствительностью в настоящий момент, безусловно, обладают молекулярно-генетические тест-системы на основе ПЦР, которые являются «золотым стандартом» для подтверждения или исключения трихомонадной инфекции [5, 12, 22].

N. gonorrhoeae, пожалуй, можно считать единственным возбудителем ИППП, для диагностики которого в равной степени имеют значение как молекулярно-генетические лабораторные тесты, так и бактериологические посевы [5, 10].

Согласно российским клиническим рекомендациям [23] применение бактериологического посева для изоляции облигатного патогена M. genitalium считается нецелесообразным, что обусловлено техническими сложностями при выделении указанного вида на питательных средах в условиях лаборатории, увеличивающими срок культивирования почти на полгода.

В заключение целесообразно обсудить необходимость рутинного бактериологического исследования вагинальной микробиоты у женщин без рисков инфицирования ИППП (моногамные сексуальные отношения или их отсутствие), без субъективных и объективных признаков инфекционно-воспалительного процесса в нижних отделах репродуктивного тракта. Иными словами, нужен ли бактериологический посев цервико-вагинального отделяемого для оценки состояния вагинальной микробиоты у здоровых женщин вне группы риска по заражению ИППП?

В соответствии с порядком оказания медицинской помощи по профилю «Акушерство и гинекология» отсутствуют показания для бактериологического исследования цервико-вагинальной микробиоты у небеременной женщины [1]. Единственным показанием для бактериологического исследования во время гестации является обнаружение в половых путях или в составе фекальной микробиоты женщин на 35–37-й неделе беременности β-гемолитического стрептококка группы В, ответственного за развитие неонатального сепсиса [24]. При выявлении указанного представителя комменсальной микробиоты беременным не проводится антибактериальная терапия по факту регистрации роста, а позже назначается интранатальная (в родах) антибиотикопрофилактика, направленная на снижение рисков колонизации новорожденного при прохождении через родовые пути [24].

В иных клинических ситуациях один факт обнаружения роста на питательных средах условно-патогенных бактерий в любых количествах у здоровой женщины не несет смысловой нагрузки для врача. Указанное обусловлено прежде всего тем, что благодаря проекту «Микробиом человека» стало известно о существовании более 300 видов (или генотипов) влагалищных бактерий [25]. Если у подавляющего большинства женщин фертильного возраста «формулой благополучия» влагалищной микроэкосистемы является доминирование Lactobacillus spp., то в некоторых этнических группах (чаще афроамериканской и испаноязычной) нередки ситуации, когда у здоровой молодой женщины абсолютно отсутствуют Lactobacillus spp., а задачи по поддержанию гомеостаза в вагинальном биотопе реализуются некоторыми условно-патогенными видами, способными участвовать в метаболизме протективной для влагалища молочной кислоты (например, Streptococcus, Atopobium vaginae и другие) [26, 27]. Более того, наряду с качественным видовым разнообразием вагинальной микробиоты в рамках проекта VIRGO на основании анализа более 1500 вагинальных метагеномов была обнаружена различная функциональная активность разных представителей одного и того же вида, что свидетельствует о наличии у женщин сугубо «персонализированной версии» влагалищной микробиоты, в том числе и в функциональном аспекте [28]. Давно установлено, что основную бактериальную массу влагалищной микробиоты (до 95%) составляют строгие анаэробы, для которых контакт с кислородом воздуха в процессе взятия материала оказывается попросту губительным. Вследствие этого для них не разработаны методики для культивирования, которые были бы доступны «на потоке» вне научно-исследовательских учреждений [17, 27–29].

Действительно, несколько десятков лет назад формирование представлений о составе вагинальной микрофлоры базировалось исключительно на результатах бактериологических методов исследования, позволяющих преимущественно выделять аэробных и факультативно-анаэробных представителей многовидовой влагалищной микробиоты, а при достаточной оснащенности бактериологической лаборатории – единичные культивируемые анаэробы [17, 29]. В свете последних открытий в области человеческого микробиома стало очевидным, что обнаруживаемые благодаря культивированию в конце XX столетия влагалищные бактериальные виды представляют собой лишь верхушку айсберга от всего видового разнообразия вагинальной микробиоты [25–28].

Забор образцов биологического материала приводит к драматическим для влагалищных микробов изменениям характеристик их естественной среды обитания: исчезновению питательных субстанций, повышению pH, снижению температуры, увеличению содержания кислорода и модификации окружающего микробного сообщества. В итоге при стандартном микробиологическом культивировании происходит отбор лишь минимальной доли микроорганизмов, составляющих менее 5% от общего числа вагинальных бактерий [17].

Большинство лабораторий при оформлении результатов бактериологических исследований нередко используют понятие «клинически значимая концентрация». Так, на сайте одной из повсеместно представленных на территории РФ коммерческих лабораторий интерпретация результатов бактериологического посева включает следующую формулировку: «В норме рост микрофлоры отсутствует или обнаружен рост нормальной или сопутствующей флоры, которая, независимо от титра, не требует проведения антибиотикотерапии. Также может быть получен рост условно-патогенных микроорганизмов в низком титре (до 10⁴ КОЕ/тампон, КОЕ/мл). В этом случае при отсутствии информации о диагнозе и/или проводимом лечении определение чувствительности к антибиотикам не проводят» [30]. Подобный вариант представления результатов бактериологического исследования вводит в заблуждение как врача, так и пациентку, поскольку количественные нормы для влагалищных комменсалов достоверно не установлены и могут варьировать в значительном диапазоне. Например, у здоровой женщины с нормоценозом во влагалищном биотопе Lactobacillus spp. могут просто «не дожить» до лаборатории в процессе транспортировки, поскольку некоторые лактобациллярные виды относятся к облигатным анаэробам в отличие от факультативно-анаэробного вида E. coli, для которого обогащенные кислородом условия in vitro не будут губительны. В итоге рост монокультуры E. coli на оптимальной для этого вида питательной среде может привести к ложной трактовке полученных результатов о наличии у женщины «инфекции в виде вагинита» и необходимости проведения антибактериальной терапии. Напротив, полное отсутствие роста в условиях лаборатории влагалищных микроорганизмов указывает лишь на ограничения методики культивирования в процессе выделения анаэробных бактерий, которыми и представлена основная масса влагалищной микробиоты, но не может восприниматься как реальное отсутствие бактериальной колонизации во влагалище.

Учитывая новые данные о численном разнообразии вагинальной микробиоты, наличии сложностей сохранения в неизменном виде уникального бактериального консорциума при взятии материала на преаналитическом этапе, ограничения в культивировании анаэробов, оценка вагинальной микробиоты клинически здоровых женщин культуральными методами может считаться не только бесполезной, но и отчасти может иметь негативные последствия из-за необоснованной антибактериальной терапии с формированием антибиотикорезистентности в популяции.

Нормативная база в гинекологии и репродуктивной медицине также не предусматривает выполнение бактериологических посевов перед плановыми гинекологическими манипуляциями и операциями, у женщин с невынашиванием и бесплодием перед процедурой экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), в акушерстве – перед наложением швов на шейку матки или установкой акушерского пессария [31–33]. Однако, к сожалению, инертность некоторых медицинских учреждений приводит к тому, что архаичный тест под названием «бактериологический посев» оказывается порой непреодолимым препятствием на пути получения женщиной хирургического лечения или к счастью материнства с помощью вспомогательных репродуктивных технологий.

Принимая во внимание представленные выше данные, важно признать, что бактериологические посевы в большинстве клинических ситуаций применяются не для диагностических целей или подбора этиотропной терапии, а в силу установившихся традиций и, как ни странно, сформировавшейся многолетней привычки.

Из-за высокой вероятности необоснованного назначения антибиотиков, отказа в получении хирургического лечения или ЭКО культуральные методы не должны применяться у пациенток без признаков инфекционно-воспалительного процесса в нижних отделах генитального тракта или указаний на возможность инфицирования ИППП (прежде всего, гонореей) в анамнезе (появление нового сексуального партнера или обнаружение гонорейной инфекции у существующего партнера). Исключением являются женщины на 35–37-й неделе беременности, у которых с помощью бактериологического посева выделяют β-гемолитический стрептококк группы В. Крайне ограниченное число гинекологических и акушерских клинических ситуаций требует использования бактериологических посевов. К ним относят рецидивирующее течение АВ и КВВ (для установления чувствительности к противомикробным препаратам), в ряде случаев – гонорейную и трихомонадную инфекции.