Немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний и самой частой причиной смерти от злокачественных новообразований во всем мире [8]. Ежегодно в России заболевают около 50 000 человек, причем 54% из них погибает на первом году после установления диагноза, так как более 65% больных обращаются к врачу с запущенными стадиями заболевания [7]. Химиотерапия и лучевая терапия при НМРЛ обладают пограничной эффективностью, что также объясняет крайне низкую выживаемость этих пациентов. Так, по данным В.И. Чиссова и соавт. [6], 3-летняя выживаемость составляет 9,8% при III стадии и около 1,5% при IV стадии заболевания.

Среди гистологических форм НМРЛ в России традиционно лидирует плоскоклеточный рак легкого (50—70% случаев), что исторически связано с курением крепкого табака и папирос без фильтра [37]. Однако в течение последних лет отмечается постепенный рост доли аденокарциномы в структуре НМРЛ (с 24,6% в 2000 г. до 34% в 2010 г.), отражающий в первую очередь смену привычек курения населения, а именно — переход на сигареты с фильтром и низким содержанием никотина [2, 5]. Кроме этого, происходит относительное увеличение количества некурящих больных НМРЛ, в особенности женщин, для которых характерен этот гистологический тип опухоли [4, 36].

Изучение генетической структуры аденокарциномы легких, в особенности аденокарциномы, не связанной с курением, привело к настоящему пониманию онкогенеза этой формы НМРЛ и выбору тактики лечения пациентов. Открытие в 2004 г. активирующих мутаций гена EGFR, объяснивших необычайную эффективность ингибитора тирозинкиназ гефитиниба у части больных НМРЛ, простимулировало интенсивный поиск других генетических нарушений, способных стать мишенью для таргетной терапии [19]. В настоящее время так называемый «генетический портрет» аденокарциномы легких представлен почти двумя десятками генов, подвергающихся различным перестройкам и обладающих в связи с этим онкогенным потенциалом [15]. Более чем к десяти из них разработаны или разрабатываются таргетные препараты, некоторые из которых уже входят в ежедневную практику онкологов. Впечатляющий успех применения гефитиниба и эрлотиниба у пациентов с мутациями гена EGFR и кризотиниба у больных с перестройками гена ALK, многообещающие результаты клинических испытаний использования ингибиторов BRAF обусловливают необходимость широкого внедрения молекулярно-генетических исследований в практическую онкологию.

Цель настоящей работы — изучить частоту распространения следующих генетических нарушений, определяющих эффективность персонализированной терапии при аденокарциноме легких: мутаций генов EGFR, KRAS, BRAF и транслокаций с участием гена ALK.

В исследование включили 493 больных НМРЛ, биопсийный материал у которых получен для анализа мутаций в 19-м и 21-м экзонах гена EGFR из различных клиник Москвы и Московской области в течение 2010—2011 гг. (табл. 1).

Среди этих пациентов была выделена группа расширенного тестирования, в которую вошли 126 больных с аденокарциномой и аденоплоскоклеточным раком, проходивших лечение в Московской городской онкологической больнице №62 в 2010—2011 гг. Средний возраст больных составил 61 год, 54% — женщины, 58% — некурящие. Алгоритм обследования включал на первом этапе исследование биопсийного материала этих пациентов на наличие мутаций в 18—21-м экзонах гена EGFR. При отсутствии этих генетических нарушений проводился поиск мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS и в 15-м экзоне гена BRAF. При диком типе исследуемых последовательностей определялось наличие перестроек гена ALK.

Определение генетических нарушений проводили на биопсийном материале, прошедшем фиксацию формалином и залитом в парафин, лишь в 4 случаях исследовали клеточный осадок плеврального выпота. Первоначально выполняли гистологическое исследование, подтверждающее диагноз НМРЛ и оценивающее количество опухолевых клеток в биоптате. При малом количестве опухолевого материала (<20% от общего количества ткани) проводили ручную макродиссекцию.

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК и РНК проводили с использованием наборов QIAmp DNA FEPE Tissue Kit и RNeasy FEPE Kit («Qiagen», Германия) или с помощью фенолхлороформного метода после предварительной депарафинизации. Определение мутаций в 18—21-м экзонах гена EGFR, 12-м и 13-м кодонах гена KRAS и 15-м экзоне гена BRAF проводили с помощью ПЦР с высокоразрешающим плавлением, фрагментного анализа, ПЦР с флюоресцентными зондами типа TaqMan и прямого секвенирования. При исследовании перестроек гена ALK для идентификации типа транскрипта EML4/ALK выполняли ПЦР после обратно-транскриптазной реакции (ОТ-ПЦР) и фрагментный анализ. Последовательности праймеров подбирали с помощью программы Primer-3 v.0.4.0. (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) или использовали опубликованные ранее [24, 30]. Исследования проводили на приборах BioRad CFX 96 («BioRad», США) и ABI 3500 («Applied Biosystems», США).

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). С помощью метода FISH исследовали перестройки гена ALK. Для проведения исследования изготавливали срезы толщиной 3 мк и после депарафинизации и протеолиза гибридизовались с пробами LSI Break Apart Rearrangement Probe («Abbot», США) и ON ALK (2p23) Break («Kreatech», Нидерланды) согласно протоколам производителей с незначительными модификациями. Результат гибридизации оценивали после просмотра препаратов в флюоресцентном микроскопе Axioimager A2 («Zeiss», Германия). Перестройку гена ALK устанавливали при обнаружении более 15% ядер опухолевых клеток с расщепленным сигналом [11].

Иммуногистохимические исследования. С помощью иммуногистохимических (ИГХ) исследований проводили дополнительную верификацию перестроек гена ALK и подтверждение мутаций в 19-м и 21-м экзонах гена EGFR в сомнительных случаях. Использовали следующие моноклональные антитела: к белку ALK, клон ALK1 («Dako», Дания), к мутантному белку EGFR c делецией в 19-м экзоне типа Е746-А750, клон 6B6 и к белку с точечной мутацией в 21-м экзоне типа L858R, клон 43B2 («Cell Signalling», США). Любое цитоплазматическое или мембранно-цитоплазматическое окрашивание расценивали как позитивное. Исследования проводили на автоматическом иммуностейнере Thermo 320 («Thermo Scientific», США).

Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием метода вычисления критерия χ² Пирсона или точного критерия Фишера путем анализа таблиц сопряженности с вычислением статистик связи.

Результаты определения мутаций в 18-м, 19-м и 21-м экзонах гена EGFR во всей группе пациентов. При исследовании материала 493 больных было обнаружено, что делеции в 19-м экзоне и мутации в 21-м экзоне типа L858R гена EGFR выявлялись почти исключительно у больных с железистой дифференцировкой опухоли (аденокарцинома, БАР, железисто-плоскоклеточный рак). Лишь в одном случае мутация в 21-м экзоне типа L858R была обнаружена в образце плоскоклеточного рака (рис. 1).

В связи с этим далее исследовали только образцы с железистой дифференцировкой опухоли (390 случаев). Среди больных этой группы мутации в 19-м и 21-м экзонах гена EGFR были обнаружены у 123 (31,3%). Делеции в 19-м экзоне выявлены у 69 больных (17,7% от всей группы или 56% среди больных с мутациями), мутации в 21-м экзоне типа L858R — у 54 человек (13,8% от всей группы или 44% среди больных с мутациями). Затем оценивали зависимость наличия мутаций в 19-м и 21-м экзонах EGFR от пола и статуса курения пациентов.

У женщин мутации обнаруживали достоверно чаще, чем у мужчин (р=0,0005) и среди некурящих пациентов в отличие от когда-либо куривших больных (р=0,0005) (табл. 2).

Результаты определения мутаций у больных группы расширенного тестирования. Мутации в 18—21-м экзоне гена EGFR были обнаружены у 43 (34%) из 126 пациентов, при этом делеции в 19-м экзоне и точечная мутация L858R в 21-м экзоне составили 90,7% всех выявленных генетических нарушений. Редкие мутации (K709E, S768I, V769L и 6-нуклеотидная инсерция в 20-м экзоне) встречались однократно, причем S768I и V769L были обнаружены у одного больного. У 4 больных проводилось иммуногистохимическое (ИГХ)-исследование, позволившее подтвердить наличие мутантного протеина EGFR при малом количестве опухолевого материала (метастатических микроочагах опухоли в легком и выраженной инфильтрации опухоли лимфоцитами).

Вследствие взаимной несовместимости мутаций генов EGFR, KRAS и BRAF для определения мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS брали только образцы с диким типом гена EGFR, а для исследования мутаций в 15-м экзоне гена BRAF — с диким типом EGFR и KRAS. Мутации в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS были обнаружены у 23 (18,2%) пациентов. Мутации определялись достоверно чаще у курящих больных (р=0,0007), при этом различия в частоте встречаемости в зависимости от пола отсутствовали (табл. 4).

Перестройку гена ALK исследовали у пациентов без мутаций генов EGFR, KRAS и BRAF. С использованием метода FISH было выявлено 7 пациентов с транслокациями при участии гена ALK (5,6% от всей группы или 12,3% среди пациентов без мутаций других исследованных генов). Материал для проведения ИГХ-исследования был получен у 6 из 7 пациентов, у всех подтверждена выраженная экспрессия протеина ALK. В одном случае выполнение ИГХ-исследования не представлялось возможным, так как исследовали осадок плеврального выпота. ОТ-ПЦР удалось провести у 6 пациентов из 7: у 5 был обнаружен химерный транскрипт EML4/ALK типа 3а/3b, у 1 — 2-го типа. В одном случае характерный транскрипт не был получен из-за выраженной деградации РНК.

Исследование структуры генетических изменений аденокарциномы легких перешло в последние годы из сферы сугубо научных интересов в область практического применения. Безусловно, наибольшее внимание уделяется выявлению активирующих мутаций гена EGFR, так как использование гефитиниба и эрлотиниба уже вошло в практику российских онкологов. В настоящем исследовании, включившем 493 больных НМРЛ, обследованных на наличие мутаций гена EGFR, были получены результаты, аналогичные ранее опубликованным в российских и зарубежных работах [1, 3, 17, 28]. В первую очередь была подтверждена практически исключительная встречаемость мутаций гена EGFR у больных с железистыми формами НМРЛ. Один случай выявления мутации у больной с морфологической картиной плоскоклеточного рака в биоптате не является противоречащим этому факту. Описания подобных единичных наблюдений периодически публикуются. Однако в подавляющем большинстве случаев тщательное ИГХ-исследование позволяет верифицировать железистую природу этих опухолей или определить аденоплоскоклеточный тип НМРЛ [22, 26]. К сожалению, крайне малый объем биоптата в нашем исследовании не позволил провести адекватное ИГХ-исследование препарата.

Достаточно высокая частота мутаций, обнаруженная в исследованной группе больных с железистыми формами НМРЛ (31,3%), отличается от данных (около 16%), опубликованных европейскими исследователями [25, 28]. Безусловно, это обусловлено значительной селекцией пациентов, вошедших в наше исследование, т.е. преобладанием некурящих (58%) и большим количеством женщин (47%), что существенно отличается от соотношения в неселектированной популяции больных НМРЛ [2]. Тем не менее при сравнении сходных групп разница в количестве пациентов с мутациями гена EGFR сохранялась, хоть и не столь выраженная. Так, в нашей группе у женщин мутации обнаружили в 46% случаев, а в группе больных, вошедших в исследование R. Rosell и соавт. [28], в 30% случаев (ОР=1,5; ДИ 95% 1,26—1,83; р=0,0005), среди некурящих в нашей группе выявили 46,5% больных с мутациями, в испанской выборке — 37,7% (ОР=1,2; ДИ 95% 1,02—1,46; р=0,0278). Сравнение этих двух выборок не является вполне корректным, так как неизвестно распределение полов в испанской группе некурящих и количество некурящих среди женщин. Тем не менее роль национальных различий между выборками не может быть полностью исключена. Этническая принадлежность традиционно входит в число факторов, определяющих частоту мутаций гена EGFR при НМРЛ [9, 17]. Известно, что у некурящих пациентов из Юго-Восточной Азии мутации гена EGFR встречаются в 60—70% случаев, у европейских больных — в 23—38% случаев [9, 21]. Небольшое количество наблюдений в нашей выборке не позволяет нам с полной уверенностью утверждать, что выявленная нами частота мутаций у российских некурящих пациентов (46,5%) достоверно занимает промежуточное положение между приведенными выше частотами, однако тенденция очевидна.

Значительное преобладание женщин среди больных с мутациями гена EGFR в нашем исследовании соответствует данным ряда ранее опубликованных работ [14, 38]. Некоторые авторы объясняют повышенную частоту мутаций и гиперэкспрессии гена EGFR у женщин более частой экспрессией на клетках опухоли рецепторов эстрогенов типа α и β, обладающих активирующим действием на сигнальный путь эпидермального фактора роста. При этом другие публикации отрицают подобную связь [23, 29].

В последнее время все больше исследователей склоняются к тому, что частота встречаемости мутаций EGFR скорее определяется статусом курения, чем полом пациента, и одинакова у некурящих женщин и мужчин, связывая это с различными путями активации онкогенеза при НМРЛ у курящих и некурящих пациентов [18, 34, 35]. В нашем исследовании различная частота мутаций у некурящих женщин и мужчин сохранялась и была статистически достоверной. Безусловно, нельзя исключить, что отмеченная нами разница может быть отчасти связана с малым количеством наблюдений или погрешностями в сборе анамнеза. Для уточнения этих закономерностей необходимо дальнейшее накопление данных.

Расширенное тестирование отдельной группы образцов, полученных от больных с железистыми формами НМРЛ, было предпринято в первую очередь для уточнения спектра активирующих мутаций в 18—21-м экзоне гена EGFR. Оказалось, что 90,7% из 43 мутаций у обследованных пациентов представлено двумя основными типами: делециями в 19-м экзоне (51,2%) и точечной заменой в 21-м экзоне типа L858R (39,5%). Другие мутации, определяющие чувствительность к гефотинибу и эрлотинибу, практически не встречались: среди 126 больных лишь в одном случае была выявлена мутация в 18-м экзоне типа К709Е (2,3%). Генетические нарушения в 20-м экзоне, предполагающие резистентность к таргетным препаратам, были определены у 2 (7%) больных, причем у одного пациента были выявлены 2 мутации. В целом результаты нашего исследования совпадают с опубликованными ранее [9, 13]. Полученные данные предполагают возможность проведения тестирования только 19-го и 21-го экзонов EGFR без расширения спектра обследования, что значительно упрощает и удешевляет исследование. Однако для максимальной достоверности необходимо проведение анализа на большей выборке больных.

Следующим этапом исследования было определение мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS у пациентов с диким типом гена EGFR. Этот этап проводили для отбора пациентов с диким типом KRAS с целью дальнейшего тестирования на мутации гена BRAF и перестройки ALK. Такое поэтапное исследование основано на взаимоисключающем характере этих генетических изменений [10, 32, 39]. Мутации гена KRAS, выявленные в 18,2% случаев, достоверно коррелировали со статусом курения пациентов. Преобладание мутаций KRAS у курящих пациентов связано с определенным путем онкогенеза, стимулированным экспозицией к табачному дыму и развитием хромосомной нестабильности. Этот путь принципиально отличается от пути, ассоциированного с мутациями EGFR, и приводит, как правило, к развитию аденокарциномы и БАР муцинозного типа [34]. До сих пор нет полной ясности, является ли мутированный статус гена KRAS фактором неблагоприятного прогноза течения НМРЛ. Несколько исследований, опубликованных в последние годы, представили противоречивые результаты. По данным метаанализа С. Mascaux и соавт. [20], включившего около 3000 пациентов, из 28 исследований мутации гена KRAS у оперированных больных ассоциировались с плохим прогнозом, в то время как в работах Т. Kosaka и соавт. [16] и С. Scoccianti и соавт. [31], выполненных на более однородных популяциях больных, такая зависимость отсутствовала. Большинство исследователей отмечают, что наличие мутаций гена KRAS обусловливает резистентность к блокаторам EGFR различного типа, и, таким образом, лишает этих пациентов возможности получать соответствующую таргетную терапию [34, 38]. К сожалению, прямые таргетные препараты, воздействующие на мутантный протеин KRAS, отсутствуют, а многочисленные попытки блокировать его сигнальный путь, выключая других участников, пока не увенчались успехом.

При дальнейшем исследовании группы пациентов с диким типом генов EGFR и KRAS нами было выявлено 3 случая с мутациями гена BRAF типа V600E (2,4%). Значение мутаций гена BRAF при НМРЛ стали изучать относительно недавно. В исследовании, опубликованном А. Marchetti и соавт., статус гена BRAF определялся в группе из 1046 больных, оперированных по поводу НМРЛ. Мутации обнаруживались практически только у пациентов с аденокарциномой (кроме 1 случая), их частота составила 4,9%, причем в 58% случаев они были представлены типом V600E. Оказалось, что общая и безрецидивная выживаемость радикально оперированных больных без мутаций BRAF и с мутацией V600E существенно отличались (15,2 против 52,1 и 29,3 против 72,4 мес соответственно). Как правило, опухоли с мутациями V600E имели микропапиллярный тип строения, считающийся признаком агрессивного течения болезни [21]. Успешное использование вемурафениба для лечения метастатической меланомы с мутациями V600E привело к повышенному интересу к применению таргетных препаратов при других солидных опухолях с такими же генетическими нарушениями и инициации исследований I и II фазы по использованию препарата GSK2118436 (дабрафениб) при НМРЛ.

Обнаружение устойчивых транслокаций с участием гена ALK при аденокарциноме легких стало еще одним знаковым событием в исследовании генетической структуры НМРЛ. Это открытие привело к появлению нового таргетного препарата кризотиниба, активность которого в группе пациентов с реарранжировками ALK оказалась сопоставима с активностью гефитиниба и эрлотиниба у больных с мутациями EGFR. По данным А. Shaw и соавт. [33], общая выживаемость больных, получавших препарат, составила 74% к первому году и 54% ко второму году от начала лечения. Кроме того, недавние публикации показали высокую эффективность пеметрекседа в этой популяции пациентов. Выживаемость больных без прогрессирования с перестройками гена ALK, лечившихся пеметрекседом, составила 9 мес в сравнении с выживаемостью больных с мутациями гена EGFR, не превышавшей 5,5 мес [12]. Перестройки гена ALK в нашей группе были выявлены у 7 пациентов, что составило 12,3% от группы больных без мутаций генов EGFR, KRAS и BRAF. Эта часть анализа обязательно включала в себя комплексное исследование с использованием методов FISH, ИГХ и ПЦР. Такой подход обусловлен тем, что каждый из методов имеет определенный лимит детекции, и только сочетание различных методов позволяет с полной уверенностью установить наличие реарранжировки. В нашем исследовании каждый случай перестройки был подтвержден как минимум двумя методами — в 6 из 7 случаев удалось определить тип транслокации как EML4/ALK. У 4 пациентов из 7 гистологический тип опухоли определялся как муцинозный с наличием перстневидных клеток, характерный для аденокарциномы с перестройками гена ALK.

Таким образом, генетические аномалии, определяющие подход к терапии аденокарциномы легких, были выявлены у 60% больных с железистыми формами НМРЛ (рис. 2).