Меланома кожи является сравнительно редкой опухолью кожи, но характеризуется самыми высокими показателями смертности среди всех злокачественных новообразований данного органа [1]. Долгое время терапия метастазирующей меланомы кожи оставалась неудовлетворительной. Однако идентификация молекулярных подтипов опухоли и последующее создание препаратов с целевым воздействием в зависимости от наличия мутации гена BRAF позволили в значительной степени изменить представление о лечении диссеминированной формы этого заболевания [2]. Внедрение в клиническую практику иммуномодуляторов — ингибиторов регуляторов контрольных точек еще в большей степени показало свою эффективность [3]. Вместе с тем быстрое развитие резистентности на фоне применения BRAF-ингибиторов [4], а также наличие высокой токсичности у иммуномодулирующих препаратов, их высокая стоимость на современном этапе не позволяют рассматривать проблему терапии метастазирующей меланомы как решенную. В этой связи сохраняется актуальность поиска новых мишеней для совершенствования подходов к ранней диагностике и лечению этого заболевания.

МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК, выполняющих регуляцию экспрессии генов на посттранскрипционном уровне [5]. МикроРНК являются критичными модуляторами многих биологических процессов, нарушение экспрессии и активности микроРНК определяется при многочисленных патологических состояниях и заболеваниях. Показано, что значительное количество микроРНК, которые получили название «онко-микроРНК» [6], связано с канцерогенезом. Изменения микроРНК при развитии злокачественных новообразований регистрируются как в опухолевой ткани, так и в периферической крови. Последнее объясняют транспортом микроРНК посредством экзосом, высвобождаемых опухолевыми клетками. Вместе с тем, выявленные изменения содержания микроРНК могут иметь практическое значение при использовании этих молекул в качестве маркеров различных заболеваний. В частности, в клиническую практику внедрена тест-система идентификации экзосомальных микроРНК [7]. Более того, осуществляется выполнение клинических испытаний терапии рака печени с помощью липосомальные инъекций miR-RX34 (clinicaltrials.gov NCT01829971), что является свидетельством возможного применения микроРНК для оптимизации терапии злокачественных новообразований.

Цель данного исследования — оценка профиля экспрессии микроРНК при меланоме кожи и доброкачественных меланоцитарных новообразованиях кожи, анализ сигнальных путей и генов мишеней, регулируемых измененными микроРНК при меланоме.

Данное исследование было утверждено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого», протокол № 59/2014 от 2 декабря 2014 г. Образцы меланомы (n=7) и доброкачественных меланоцитарных новообразований кожи (n=6) получены от пациентов, наблюдавшихся в Красноярском краевом онкологическом диспансере. При осуществлении отбора пациентов для исследования учитывались различные клинико-морфологические показатели, такие как пол, возраст, толщина опухоли по Бреслоу, клинико-морфологическая форма заболевания, локализация новообразования. При этом в исследования включались пациенты, различающиеся по данным критериям. Клинико-морфологические критерии включенных в исследование пациентов с меланомой кожи представлены в табл. 1.

Все образцы ткани фиксированы в РНК-стабилизирующем растворе RNLater («Ambion», США). Выделение РНК осуществлялось с помощью набора RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation kit («Ambion», Литва) согласно протоколу производителя. Концентрация микроРНК оценивалась с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Singapore) с применением Qubit microRNA Assay kit (Ref. Q32880, «Eugene», США).

Микрочипирование выполнялось с помощью GeneAtlas Microarray System («Affymetrix», CA, США). Образцы РНК подвергались биотинилированию (Affymetrix Flash Tag Biotin HSR (Ref. 901913, «Affymetrix», CA, США), гибридизировались 48 °C в течение 20 ч на стрипе Affymetrix miRNA 4.1 Array Strip («Affymetrix», США) с использованием реагентов Gene Chip GeneAtlas Hybridization and Stain Module (Ref. 902135) («Affymetrix», CA, США). После гибридизации чипы подвергались промывке на приборе Fluidic Station («Affymetrix», CA, США). Интенсивность флуоресцентного сигнала детектировалась на приборе Imaging Station, GeneAtlas Microarray System. Контроль качества гибридизации производился на всех этапах работы от постановки реакции полиаденилирования до детекции посредством использования контрольных образцов. Обработка данных флюоресценции производилась при помощи программы Expression Console software (Build 1.4.0.38) («Affymetrix», США).

Для валидации результатов микрочипирования выбраны три микроРНК — miR-363−3p (MIMAT0000707), miR-513a-5p (MIMAT0002877), miR-3591−3p (MIMAT0019877). Отбор микроРНК для этого проводился с учетом таких характеристик, как кратность изменения микроРНК в исследовании, различная длина микроРНК (от 20 до 23 нуклеотидных пар), различие GC-пар в составе каждой из микроРНК. Валидация результатов посредством микроРНК, выбранных по максимально различающимся признакам, позволяет подтвердить достоверность результатов микрочипирования и возможность дальнейшей интерпретации результатов микрочипирования. Реакция обратной транскрипции выполнялась с помощью miRNA TaqMan Assays (Cat. No 4427975, «Applied Biosystems», США) с применением набора Реверта («AmpliSens», Россия) при температуре 37 °C в течение 30 мин 1,33 мкл кДНК добавлялся к ПЦР смеси, содержащей 8 мкл 2,5хRT-PCR с добавлением ROX («Syntol», Россия), 1 мкл 20x раствора праймеров и пробы, 9,67 мкл деионизированной воды. U6snRNA и RNU6B использовались в качестве эндогенных контролей («Applied Biosystems», США). Постановка реакции осуществлялась на приборе StepOne Real-Time PCR System («Applied Biosystems», Сингапур) с применением следующего температурного режима: 50 °C — 2 мин, 95 °C — 10 мин, затем 40 циклов 95 °C — 15 с и 60 °C — 1 мин. Данные анализировались по методу ΔΔC_t.

Анализ сигнальных путей проведен при помощи программы DIANA-mirPath версия 3,0 согласно классификации KEEG (Киотская классификация генов и геномов). Пороговые величины определялись с помощью точного критерия Фишера. При уровне значимости p≤0,05. Гены-мишени для микроРНК определялись на основе данных DIANA-micro-T-CDS и miRDB, при этом для анализа использовались гены-мишени с target score 99 и 100. Анализ онтологии генов проводился при помощи биоинформационной базы PANTHER версия 8,0.

Статистическая обработка данных микроэррея осуществлялась при помощи программы Transcriptome analysis Console 2,0. Различия в экспрессии микроРНК между тканью меланомы и тканью доброкачественных меланоцитарных новообразований считались значимыми при p≤0,05. Упорядочивание данных, имеющих значимые различия, проводилось при помощи программы Transcriptome analysis Console 2,0 методом иерархической кластеризации на тепловой карте.

Профилирование микроРНК меланомы и доброкачественных меланоцитарных новообразований выявило 62 микроРНК, уровни которых изменены в меланоме по сравнению с невусами. Из них 31 микроРНК показала повышенные уровни экспрессии и 31 показала сниженные уровни экспрессии в меланоме по сравнению с меланоцитарными невусами. При этом наиболее статистически значимые изменения между группами пациентов с меланомой и невусами представлены в следующих микроРНК (табл. 2). Результаты иерархической кластеризации представлены на рисунке,.

В дальнейшем данные результатов микрочипирования подтверждались посредством определения уровня экспрессии микроРНК, выбранных на основе критериев, указанных выше в разделе «Материал и методы» при помощи ПЦР в реальном времени. С этой целью определялись уровни miR-363−3p, miR-513a-5p, miR-3591−3p. По результатам микроэррея и ПЦР в реальном времени в данной работе не выявлено различий в уровне miR-363−3p между образцами меланомы и меланоцитарных невусов. При этом изменения данной микроРНК были статистически незначимы при оценке не только данных микрочипирования, но и данных ПЦР в режиме реального времени. Экспрессия miR-513a-5p снижена в меланоме по сравнению с доброкачественными меланоцитарными опухолями, что регистрировалось посредством микрочипирования и ПЦР в реальном времени. Не было также выявлено различий в уровне miR-3591−3p в меланоме и меланоцитарных невусах по результатам обоих методов (p>0,05).

Таким образом, валидация результатов микрочипирования при помощи ПЦР в режиме реального времени продемонстрировала полное совпадение данных двух методов и возможность дальнейшего использования результатов, полученных при помощи микрочипирования.

48 механизмов передачи сигнала определены посредством биоинформационного анализа как измененные в образцах меланомы по сравнению с меланоцитарными невусами. Механизмы передачи сигнала, регулируемые микроРНК с наиболее высоким уровнем изменений, включали сигнальные пути митогенактивируемых протеинкиназ (МАPК), p53, NF-kappa B, ErbB — сигнальный путь, процессы убиквитинзависимого протеолиза и деградации лизина (табл. 3).

Биоинформационный анализ генов-мишеней и сигнальных каскадов, регулируемых максимально повышенной микроРНК — miR-3065−5p, выявил у нее 184 гена-мишени, из них 30 имели target score 100 и 99. К таковым генам-мишеням miR-3065−5p относится PTPN11 (Homo sapiens protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11), HMGB1 (high-mobility group protein B1), ME1, кодирующий НАДФН-зависимый маликфермент 1, PCDH9, кодирующий протокадгерин-9 (табл. 4). Функциональная роль генов-мишеней miR-3065−5p связана с 48 биологическими процессами, включающими ангиогенез, ответ на окислительный стресс, метаболизм пирувата, сигнальные каскады MAPK, RAS, p53, EGFR, Wnt (табл. 5).

На сегодняшний день идентифицировано 2588 функционально зрелых микроРНК согласно базе данных Mirbase (www.mirbase.org). С учетом этого 62 микроРНК, уровни которых различаются при меланоме и меланоцитарных невусах, являются сравнительно небольшой цифрой. Все данные микрочипирования совпали с результатами оценки экспрессии микроРНК посредством ПЦР в реальном времени, что свидетельствует в пользу достоверности изменений профиля микроРНК, установленных на основе применения микроэррея. При этом, безусловно, необходимо проведение дополнительного расширения выборки пациентов с меланомой кожи и доброкачественными меланоцитарными новообразованиями кожи и дальнейшее продолжение данного исследования.

Хорошо известно, что механизм передачи сигнала MAPK играет одну из ключевых ролей в патогенезе меланомы [8]. Безусловная роль отводится сигнальному каскаду NF-kappa B, конститутивная активация при меланоме которого приводит к развитию резистентности к апоптозиндуцирующим стимулам [9]. Выявлено, что одним из негативных регуляторов NF-kappa B является miR-377, наблюдаемое отсутствие экспрессии которой при меланоме способствует инвазивному росту и метастазированию данной опухоли [10]. Нарушение процессов убиквитинзависимого протеолиза и деградации лизина наблюдается при многих злокачественных заболеваниях. В частности, посредством убиквитинпротеосомной системы осуществляется регуляция на уровне белков модуляторов клеточного цикла — циклинзависимых киназ и p53 [11]. В целом стоит отметить, что сигнальные механизмы, изменения которых выявлены посредством биоинформационного анализа в меланоме, известны как играющие роль в меланомогенезе, что в свою очередь свидетельствует об адекватности исследования, проводимого на основе микрочипирования.

К генам-мишеням максимально повышенной при меланоме miR-3065−5p относится PTPN11, кодирующий белок SHP2. SHP2 является компонентом нескольких внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в эмбриональном развитии, которые модулируют клеточное деление, дифференцировку и миграцию, в том числе при посредничестве рецептора эпидермального фактора роста. Интересно, что синдром LEOPARD, проявляющийся рядом признаков, включающих стеноз легочной артерии, нейросенсорную глухоту, задержку роста, а также появление множественных лентигинозных пигментных пятен на кожных покровах, может быть обусловлен не только мутациями гена BRAF (3-й тип синдрома), но также и мутациями гена PTPN11 (1-й тип синдрома) [12]. Еще одним геном, экспрессия которого регулируется miR-3065−5p, является HMGB1. Известно, что при воздействии ультрафиолетового излучения кератиноциты высвобождают белок HMGB1, который в свою очередь вызывает активацию нейтрофилов. Последние способствуют периваскулярной миграции опухолевых клеток первичной меланомы в легкие, приводя тем самым к формированию дистантных метастазов [13].

Маликфермент 1, кодируемый геном ME, также находится под регуляторным контролем miR-3065−5p. Изменение функционирования данного белка определено при многих видах злокачественных новообразований [14]. В частности, в клетках рака печени маликфермент 1 активирует процессы эпителиально-мезенхимального перехода. Высокие уровни данного белка коррелируют с низкими показателями выживаемости пациентов [15]. Снижение уровня маликфермента 1 и маликфермента 2 влияет на активность Р53 и вызывает старение клеток, но не приводит к индукции их гибели посредством апоптоза [16]. Таким образом, сравнительная оценка характера экспрессии микроРНК позволяет идентифицировать новые молекулы-мишени для целенаправленного воздействия с целью модуляции различных процессов, ассоциированных с канцерогенезом. В таких случаях биоинформационный анализ больших объемов данных может служить основой для выбора целевых молекул с их дальнейшим экспериментальным исследованием.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 14−15−00074)

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.Г.Р.

Сбор и обработка материала: М.Б.А., Н.В.П., А.В.К.

Статистическая обработка: М.Б.А., Н.В.П., А.В.К.

Написание текста: М.Б.А.

Редактирование: Т.Г.Р.

Конфликт интересов отсутствует.