В настоящее время единственным эффективным методом лечения рака желудка (РЖ) является хирургический, но данный метод дает хороший результат лишь при ранних стадиях заболевания. У большинства пациентов диагноз устанавливают на поздних стадиях заболевания, когда хирургическое лечение уже нерадикально, а подчас и невыполнимо. В связи с этим успешное лечение рака зависит от его своевременной диагностики.

Одним из направлений ранней диагностики и выбора тактики ведения пациентов с онкологическими заболеваниями служит определение онкомаркеров. Они должны помочь в определении риска развития онкологического заболевания, выявлении предполагаемого источника опухоли, предупреждении рецидивов рака, оценке эффективности проводимого лечения.

В настоящей статье, используя результаты собственных исследований, показана возможность внедрения в хирургическую практику систем молекулярных маркеров на примере РЖ.

Цель исследования — оценка генетического состояния слизистой оболочки желудка у больных раком для разработки системы, основанной на молекулярных маркерах, которая позволит улучшить диагностику РЖ, сможет дать прогноз течения заболевания, помочь в выборе тактики лечения [1].

Исследование проводили на базе клиники факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

С целью поиска системы для диагностики РЖ, основанной на молекулярных маркерах, провели исследование, в которое были включены 156 больных: 106 РЖ и 50 желчнокаменной болезнью (ЖКБ), послуживших группой сравнения. Все пациенты находились под наблюдением в период с 2008 по 2011 г.

Среди больных, включенных в исследование, было 87 (55,8%) мужчин, 69 (44,2%) женщин. В исследовании преобладали пациенты старше 60 лет.

Во всех биопсийных образцах от пациентов с ЖКБ было подтверждено отсутствие опухолевых клеток и установлен диагноз атрофического гастрита без кишечной метаплазии и дисплазии эпителия.

Больные РЖ были оперированы. В зависимости от локализации и формы роста опухоли, объема поражения проводили операции в следующем объеме: при раке пилороантрального отдела и поражении нижней трети выполняли субтотальную дистальную резекцию желудка с лимфаденэктомией в объеме D1, D2 или D3; при инфильтративном раке нижней трети желудка с распространением на среднюю треть, раке тела желудка с распространением на дно, а также субтотальном поражении органа у больных с первично-множественной опухолью проводили гастрэктомию с лимфаденэктомией в объеме D1, D2 или D3; при местно-распространенных формах выполняли комбинированные операции: субтотальную резекцию желудка или гастрэктомию с резекцией абдоминального отдела пищевода, поджелудочной железы, поперечной ободочной кишки, печени, со спленэктомией, лимфаденэктомией в объеме D1, D2 или D3.

В работе использована оригинальная система молекулярных маркеров, состоящая из трех частей.

Первая часть включала определение в опухолевой ткани аномального метилирования генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, приводящего к их инактивации [2].

Ген CDH1 — один из основных генов, определяющих канцерогенез желудка; он кодирует E-кадгерин — белок клеточной адгезии.

Ген RASSF1А — ген-супрессор, участвует в регуляции клеточной пролиферации и апоптозе, кодирует фактор, контролирующий клеточный цикл.

Ген MLH1 — ген-супрессор, кодирует фактор, участвующий в репарации неспаренных оснований, возникающих вследствие ошибок репликации ДНК.

Ген N33 проявляет супрессорные функции и демонстрирует высокий уровень метилирования в различных типах опухолей, происходящих из эпителия.

Ген DAPK кодирует белковую киназу, обеспечивающую апоптоз и предотвращающую опухолевую прогрессию в результате ингибирования поляризации клетки [3]. Инактивация гена DAP-киназы приводит к усилению миграции и инвазии опухолевых клеток, препятствует апоптозу.

Вторая часть панели молекулярных маркеров включала определение экспрессии генов hTERT, ММР7, ММР9, BIRC5, СОХ-2, TP53 [4].

Матриксные металлопротеиназы — протеазы, способные лизировать все структурные компоненты внеклеточного матрикса, продуцируются клетками стромы вокруг опухоли; их высокую продукцию связывают с метастазированием, неоангиогенезом, плохим прогнозом течения заболевания.

ММР7 (матрилизин) — металлопротеиназа, секретируемая эпителием опухоли, ее экспрессия коррелирует с гистологической агрессивностью опухоли.

ММР9 (желатиназа В) — металлопротеиназа, определяемая в здоровых растущих клетках, играет ведущую роль в ангиогенезе, в опухоли обеспечивает неоангиогенез, способствуя росту опухоли.

Сурвивин (Sur, survivin) — эндогенный белок, относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза. В норме он участвует в процессах митоза и эмбрионального развития, в опухолях ген сурвивина (BIRC5) экспрессируется в больших количествах и подавляет апоптоз.

Циклооксигеназа-2 (COX-2) катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2 на I стадии биосинтеза простагландинов, тромбоксанов и простациклинов. COX-2 увеличивает темп развития кровеносных сосудов и рост опухоли, а также блокирует развитие апоптоза. Ген циклооксигеназы-2 – PTGS2.

Ген TP53 кодирует транскрипционный фактор, который при повреждении генома вызывает задержку клеточного цикла в фазе G₁ и способствует апоптозу. В опухолевых клетках происходит нарушение функции гена: программа апоптоза переключается на программу неограниченной пролиферации.

В третьей части панели определяли активность теломеразы – белка, синтезируемого опухолевой клеткой [5, 6]. В качестве белкового маркера была выбрана теломераза, продукт экспрессии гена hTERT, — фермент, необходимый для поддержания стабильности хромосом в процессе деления клетки, играющий ключевую роль в поддержании пролиферативного потенциала клеток и опухолевого роста.

Таким образом, была использована сложная панель молекулярных генетических маркеров, состоящая из ДНК-, РНК- и белковых маркеров.

С целью определения прогностических маркеров прогрессирования РЖ мы провели ретроспективно-проспективное исследование, в которое вошли 103 пациента, оперированных по поводу РЖ в период с 2006 по 2009 г. Срок наблюдения за пациентами составил не менее 3 лет.

В ходе исследования отдаленные результаты хирургического лечения изучали в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции. При этом оценивали молекулярно-генетические изменения (аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, RUNX3) в биоптатах из слизистой оболочки культи желудка у больных, ранее оперированных по поводу рака. Проведен корреляционный анализ молекулярно-генетических изменений в биоптатах из слизистой оболочки культи желудка с такими характеристиками опухоли, как глубина инвазии в стенку желудка, степень дифференцировки, размер первичной опухоли, прохождение линии резекции в зоне первичной опухоли. Оценены перспективы использования системы молекулярно-генетических маркеров в качестве прогностического фактора риска генерализации процесса и развития рецидива.

Среди пациентов, включенных в исследование, были 54 (52,4%) мужчины и 49 (47,6%) женщин. Средний возраст больных составил 67 лет (от 48 до 86 лет).

После предварительной подготовки всем больным выполнено плановое оперативное вмешательство на органах брюшной полости.

Выбор объема операции определяли локализацией и размером опухоли, распространенностью (вовлечение соседних органов в опухолевый процесс), наличием отдаленных метастазов, морфологическими характеристиками новообразования, возрастом и общим состоянием пациента.

Показаниями к субтотальной дистальной резекции желудка считали опухоли антрального отдела и нижней трети тела желудка при отсутствии в его проксимальном отделе предраковых изменений слизистой оболочки, таких как полипы, тяжелая дисплазия. Проксимальную резекцию выполняли при раке кардиального отдела желудка, не прорастающем в серозный покров, размером до 4 см. Также всем больным была выполнена расширенная лимфаденэктомия: в объеме D2 — 10 (9,7%) пациентам, D2.5 — 88 (85,4%), D3 — 5 (4,9%).

В работе использована панель молекулярных маркеров, которая включала определение аномального метилирования генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK и дополнительно гена RUNX3.

RUNX3 — ген-супрессор опухолевого роста, функционирует во множестве опухолей разного типа.

В общей группе наблюдения было 103 больных, показатель 2-летней выживаемости составил 98±0,06%, 3-летней — 97±0,09%.

В настоящем исследовании оценили молекулярные изменения в послеоперационных биоптатах морфологически неизмененной слизистой оболочки, полученных при эзофагогастродуоденоскопии в срок от 6 до 39 мес после первичного хирургического лечения.

Из 6 исследуемых генов аномальное метилирование в послеоперационных биоптатах из слизистой оболочки культи желудка определено для генов N33, CDH1, RUNX3.

Для оценки роли молекулярных изменений при комбинированном лечении РЖ провели исследование, в которое были включены 80 больных с местно-распространенным РЖ, находившихся на лечении в клинике в период с 2009 по 2017 г.

Всем 80 больным из группы исследования выполнено плановое оперативное вмешательство: субтотальная дистальная резекция желудка у 15 (19%), предельно субтотальная дистальная резекция желудка у 19 (24%), гастрэктомия у 46 (57%). Лимфаденэктомия в объеме D1 выполнена у 3 (4%) больных, D2 — у 41 (51%), D2.5 — у 32 (40%), D3 — у 4 (5%).

У 43 (54%) из 80 больных оперативное вмешательство имело комбинированный характер, причем у одного больного могло быть удалено или резецировано два органа и более: у 36 (45%) больных выполнена принципиальная холецистэктомия, резекция пищевода — у 30 (37%), резекция ножек диафрагмы — у 8 (10%), спленэктомия — у 8 (10%), резекция поджелудочной железы — у 5 (6%), резекция брыжейки ободочной кишки — у 3 (4%), резекция поперечной ободочной кишки — у 1 (1%), атипичная резекция печени — у 1 (1%), адреналэктомия слева — у 1 (1%).

Всем пациентам провели гистологическое патоморфологическое исследование материала, полученного интраоперационно.

Проводили адъювантную химиотерапию с включением 5-фторурацила (5-ФУ) 58 пациентам. Внутрибрюшную инфузию химиопрепаратов проводили больным с установленным на дооперационном этапе диагнозом перстневидно-клеточного Р.Ж. Во время операции оставляли катетер в брюшной полости и вводили препарат платины на 10-й день после операции, после чего катетер удаляли.

Для оценки отдаленных результатов лечения у всех 80 больных изучили связь полиморфизмов генов TYMS и ТР53 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли. У 58 больных, которым, помимо хирургического лечения, проводили адъювантную химиотерапию, исследовали связь состояния полиморфных вариантов генов TYMS и ТР53 с эффективностью проведенного лечения, которую оценивали по возникновению рецидива РЖ, а также продолжительности общей и безрецидивной выживаемости.

Ген TYMS кодирует фермент тимидилатсинтазу (ТС), участвующий в синтезе de novo нуклеотидов тимина и урацила, следовательно, служит мишенью для лекарственных средств, в частности 5-ФУ.

Использование молекулярных маркеров в диагностике РЖ. Приводим анализ чувствительности и специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов, точности, отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов, отношения шансов диагностического теста метилирования генов MLH1, RASSF1A, экспрессии генов hTERT, ММР7, BIRC5, активности теломеразы для определения ценности данных маркеров в диагностике РЖ (см. таблицу).

Мы исключили показатели метилирования генов N33, CDH1, DAPK из конечного варианта, так как определенный уровень метилирования выявляется в биоптатах условно нормальной слизистой оболочки желудка у пациентов с опухолями, а также некоторых пациентов с ЖКБ в отсутствие РЖ. В анализ не включено исследование экспрессии TP53, поскольку в биоптатах из опухоли показатель экспрессии гена TP53 не имел статистически значимой разницы по сравнению с биоптатами слизистой оболочки желудка из близлежащих и отдаленных от опухоли участков. Кроме того, мы сочли возможным исключить показатели экспрессии ММР9, PTGS2, так как не отметили статистически значимой разницы между уровнями экспрессии данных генов в биоптатах из опухоли и биоптатах слизистой оболочки в группе сравнения (больные ЖКБ).

Согласно полученным результатам, средняя чувствительность предложенной системы составляет 54%, специфичность — 94,5%. Определение экспрессии генов hTERT, BIRC5, а также активности теломеразы полезно в диагностике рака, поскольку их чувствительность превышает 60%, а специфичность достаточно высока — более 88%.

В то же время определение экспрессии ММР7 наиболее полезно, поскольку этот маркер обладает наибольшей из всех составляющих чувствительностью (примерно 85%) и довольно хорошей специфичностью. При этом уровень экспрессии hTERT показывает, что вероятность выявления заболевания у пациентов с положительным результатом теста по сравнению с пациентами с отрицательным результатом теста выше в 163,9 раза.

Исследование аномального метилирования генов RASSF1А и MLH1, хотя и считается наиболее специфичным маркером, обладает низкой чувствительностью и может применяться только в качестве дополнительного маркера.

Одной из основных задач этого исследования была оценка возможности и целесообразности определения молекулярно-генетических маркеров РЖ в дооперационном периоде. В ходе проведенного исследования подтверждена возможность использования для лабораторной диагностики биопсийного материала, полученного в результате дооперационного эндоскопического исследования. Определено, что количество ДНК и РНК, получаемое из эндоскопического образца, вполне достаточно для проведения серии молекулярно-генетических исследований. Использование эндоскопического материала наравне с образцами, полученными во время операции, позволит повысить выявление опухолей желудка на этапе предоперационной диагностики, что приведет к улучшению диагностики рака на ранних стадиях.

Молекулярно-генетические маркеры, определяемые в биоптатах слизистой оболочки желудка, вместе с клиническими, лабораторными и инструментальными данными позволяют увеличить точность и скорость дооперационной диагностики.

Уточнение хирургической тактики с учетом показателей молекулярных и генетических маркеров. Учитывая наличие статистически значимой разницы в показателях нашей системы, можно утверждать, что опухоль отличается наличием определенных изменений, которые не происходят в слизистой оболочке желудка в отсутствие ракового поражения. Определив порог этих изменений в слизистой оболочке желудка, можно предположить границу между опухолью и нормальной слизистой оболочкой и уточнить края резекции при хирургическом лечении, что было сделано на следующем этапе работы.

Однако из нашего исследования следует, что морфологически нормальная слизистая оболочка, отдаленная от опухоли, у некоторых больных РЖ характеризуется наличием эпигенетических изменений, свойственных больше для опухолевой ткани, чем нормальной (слизистая оболочка желудка у больных ЖКБ). Высокий уровень метилирования генов CDH1, N33, DAPK в морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевой, у некоторых больных РЖ косвенно может указывать на вовлеченность этой ткани в опухолевый процесс. Таким образом, для определения границы резекции подходят экспрессионные маркеры hTERT, MMP7, BIRC5, а также активности теломеразы, уровни которых поднимаются только в опухоли и статистически значимо снижаются в окружающей слизистой оболочке, расположенной на 5 см ниже и выше опухолевого узла. Отсутствие изменений экспрессионных маркеров позволяет заключить, что операции (субтотальная дистальная резекция или проксимальная резекция желудка), выполняемые при ограниченном антральном или проксимальном росте опухоли, вполне обоснованы, поскольку произведены в пределах не только морфологически сохранных тканей, но и на фоне незначительных молекулярных и генетических изменений. С учетом полученных данных по использованию новых молекулярно-генетических маркеров можно утверждать, что объемы операций являются адекватными и не требуют увеличения, а сами маркеры могут служить дополнительными показателями молекулярно-генетической чистоты линии резекции, коррелирующими с данными гистологического исследования.

Таким образом, для адекватной дооперационной оценки молекулярно-генетических изменений слизистой оболочки у больных РЖ целесообразно использовать комплексную панель, включающую маркеры различных стадий канцерогенеза и пригодную на этапах как диагностики, так и лечения. Определение метилирования генов RASSF1А, MLH1, экспрессии генов ММР7, hTERT, BIRC5, а также активности теломеразы рекомендуется использовать для диагностики РЖ в сочетании с другими методами исследования.

Роль молекулярных маркеров в определении прогноза рецидива РЖ. Субтотальная дистальная резекция желудка — одна из наиболее часто выполняемых операций при радикальном хирургическом лечении рака дистального отдела желудка.

Отсроченное метилирование в культе желудка не связано с локализацией опухоли, ее размером, опухолевой дифференцировкой, наличием инвазивного роста, чистотой линии резекции и метастазами в лимфатических узлах, однако статистически значимо коррелирует с наличием отдаленных метастазов, сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и генерализацией опухолевого процесса.

Исследование аномального метилирования генов CDH1, N33, RUNX3 следует использовать для оценки состояния морфологически неизмененной слизистой оболочки культи желудка для динамического наблюдения за больными с целью выявить генерализацию опухолевого процесса еще до инструментального ее подтверждения и своевременной коррекции химиотерапии.

Таким образом, в окончательный вариант системы предиктивных маркеров рецидива и генерализации РЖ включено определение метилирования только генов CDH1, N33, RUNX3 как самых ранних событий в процессе канцерогенеза, приводящих к эпигенетическому изменению генов, создающих определенный потенциал нестабильности, но способных и не реализоваться в виде роста опухоли и генерализации опухолевого процесса.

Роль молекулярных маркеров в определении тактики комбинированного лечения больных Р.Ж. Подходы к лечению местно-распространенного РЖ. Статистически значимые различия выявлены у больных, имеющих полиморфизмы в 3UTR гена TYMS. Отмечено, что генотип А-6/А-6 статистически значимо чаще встречается у пациентов с высоко- и умеренно-дифференцированными аденокарциномами, а также при интестинальном типе РЖ по классификации Р. Lauren.

Статистически значимой связи исследуемых полиморфизмов генов TYMS и ТР53 и перстневидно-клеточного рака выявлено не было. Однако генотип А-6/А-6 у пациентов с перстневидно-клеточным раком не обнаружен ни в одном случае.

Проведенный анализ частоты полиморфизмов гена TYM и метастатического поражения регионарных лимфатических узлов показал, что у пациентов, имеющих генотип 2R/2R, статистически значимо чаще выявляется метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов. По остальным полиморфизмам гена TYMS, в том числе сочетанным, статистически значимой взаимосвязи с поражением лимфатических узлов не получено.

Нам впервые удалось показать, что определенные полиморфные варианты гена TYMS, в частности наличие тандемного повтора 2R/2R, статистически значимо связаны с возможностью метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

При анализе двух полиморфных вариантов гена ТР53 и клинико-морфологических характеристик РЖ какой-либо статистически значимой связи не установлено.

Связь полиморфизмов генов ТР53 и TYMS с эффективностью адъювантной химиотерапии на основе 5-фторурацила. Проведен статистический анализ частоты полиморфизмов генов ТР53 и TYMS и развития рецидива РЖ в течение первых 3 лет после радикальной операции в сочетании с адъювантной химиотерапией на основе 5-ФУ. Пациенты были разделены на две группы: 30 больных, у которых за время наблюдения выявлен рецидив заболевания (местный рецидив, канцероматоз брюшины, отдаленные метастазы), и 28 больных, у которых в процессе наблюдения заболевание не прогрессировало. Медиана наблюдения составила 33 мес.

В результате проведенного исследования полиморфизмов гена ТР53 определено, что у больных с генотипом 3G/3G и Pro/Pro в течение первых 3 лет после радикальной операции в сочетании с адъювантной химиотерапией статистически значимо чаще развивался рецидив заболевания. Генотипы 2G/3C и Arg/Pro статистически значимо чаще отмечали в группе пациентов, у которых не возник рецидив заболевания.

Связь полиморфизмов генов TYMS и ТР53 с отдаленными результатами комбинированного лечения больных РЖ. При изучении корреляции полиморфизмов гена TYMS установлено, что безрецидивная и общая выживаемость статистически значимо ниже у больных с генотипом 3R/3R по сравнению с 3R/2R.

При изучении полиморфизмов гена ТР53 в кодоне 72 и интроне 3 установлено, что безрецидивная выживаемость при генотипе Arg/Arg в среднем составила 29,1 мес, при генотипах Pro/Pro иArg/Pro — 20 и 29,5 мес соответственно.

Возможности использования молекулярных маркеров в определении тактики комбинированного лечения больных РЖ. Исследования показали, что для улучшения результатов лечения больных местно-распространенным РЖ целесообразна оценка некоторых молекулярных факторов, которые определяют индивидуальные различия в фармакодинамике и фармакокинетике лекарственных средств, а также связаны с течением заболевания, прогнозом и ответом на лечение, что позволит в дальнейшем осуществлять оптимальный подход к выбору схемы химиотерапии.

При изучении связи полиморфизмов с клинико-морфологическими характеристиками РЖ у больных выявлены генотипы, статистически значимо коррелирующие с благоприятным клиническим течением опухолевого процесса. К таким генотипам гена TYMS относятся А-6/А-6, 2G/3C, а гена TP53 — Arg/Pro. Генотип А-6/А-6 статистически значимо чаще встречается у больных с высоко- и умеренно-дифференцированной аденокарциномой и интестинальным типом РЖ; генотипы 2G/3C и Arg/Pro — у больных с отсутствием рецидива РЖ в течение первых 3 лет после радикальной операции на фоне адъювантной химиотерапии с применением схем на основе 5-ФУ. С неблагоприятным течением связаны генотипы 2R/2R, 3G/3G (TYMS) и Pro/Pro (TP53). Генотип 2R/2R чаще определяется при метастатическом поражении регионарных лимфатических узлов, а генотипы 3G/3G и Pro/Pro — у больных с возникшим рецидивом рака также в течение 3 лет после радикальной операции на фоне адъювантной химиотерапии.

В ходе исследований показана возможность внедрения в хирургическую практику систем молекулярных маркеров на примере Р.Ж. Удалось доказать, что для адекватной дооперационной оценки молекулярно-генетических изменений слизистой оболочки у больных РЖ целесообразно использовать комплексную панель, включающую маркеры различных стадий канцерогенеза. Определение метилирования генов RASSF1А, MLH1, экспрессии генов ММР7, hTERT, BIRC5, а также активности теломеразы целесообразно использовать для диагностики РЖ на ранних стадиях в сочетании с другими методами исследований.

Система предиктивных маркеров рецидива и генерализации РЖ должна включать определение метилирования генов CDH1, N33, RUNX3.

Для улучшения результатов лечения больных местно-распространенным РЖ при использовании комбинированной терапии целесообразна оценка ряда молекулярных факторов, которые определяют индивидуальные различия в фармакодинамике и фармакокинетике лекарственных средств, а также связаны с течением заболевания, прогнозом и ответом на лечение. Так, дооперационное генотипирование можно использовать для определения эффективности адъювантной химиотерапии на основе фторпиримидинов (5-ФУ) после радикального хирургического лечения больных местно-распространенным РЖ, что лежит в основе выбора оптимальной тактики лечения больного, так как генотипы 2R/3R, Arg/Pro и Arg/Arg связаны с лучшей эффективностью схем химиотерапии на основе 5-ФУ, а генотипы 3R/3R и Pro/Pro — с худшей, что было показано в результате нашего исследования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.И.Б., Т.В.Х.

Сбор и обработка материала — И.И.Б., М.В.Н., А.С.М.

Статистическая обработка — И.И.Б., М.С.М.

Написание текста — И.И.Б., М.С.М.

Редактирование — Т.В.Х., М.В.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Микерова Мария Сергеевна — https://orcid.org/0000-0003-2718-1895; e-mail:masha-med@mail.ru