На сегодняшний день остается актуальной проблема восстановления кожи у пациентов с глубокими и обширными термическими поражениями, несмотря на совершенствование методов оперативного лечения больных с ожоговой травмой [1]. После выполнения некрэктомий в качестве временных покрытий используются трупные аллотрансплантаты, ксенотрансплантаты, синтетические материалы [2, 3]. К сожалению, в настоящее время в России нет законодательной базы, разрешающей использование аллотрансплантатов. Однако указанные покрытия не могут быть применены для восстановления целостности кожи и не исключают традиционного метода закрытия раневых поверхностей с помощью аутодермопластики расщепленными свободными кожными трансплантатами. При глубоких и обширных термических поражениях может возникнуть нехватка донорских аутодермотрансплантатов. В таких ситуациях становится необходимым использование клеточной терапии [4—6].

Клеточная терапия — введение живых клеток, направленное на улучшение регенерации в тканях, поддержку или восстановление функции (например, заживление ожоговых ран) или модуляцию патофизиологических процессов (например, воспаление и иммунная реакция) [4]. Начиная с 2016 г. в России появилось понятие «биомедицинский клеточный продукт» — материал, предназначенный для клеточной терапии (Федеральный закон от 23.06.16 № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах»).

Развитие клеточных технологий начинает свою историю еще в середине XX века. В 1907—1910 гг. американец Росс Гренвилл Гаррисон, биолог, врач и эмбриолог, описал методику культивирования живых клеток в условиях лаборатории, его труды получили развитие в 40—50-х годах XX века. До середины 70-х годов XX века фибробласты были единственными клетками, активно использовавшимися в медицинской деятельности из-за их способности сохранять диплоидный кариотип ростовых процессов in vitro, частично лишаться поверхностных антигенов гистологической совместимости [7], длительно культивироваться [8].

Сегодня накоплен опыт по получению и применению разных типов клеток для закрытия раневых дефектов кожных покровов, таких как кератиноциты, фибробласты и мезенхимальные стромальные клетки разного происхождения [3]. Однако до сих пор получение полноценной кожи тканеинженерного происхождения, которая заменила бы аутодермопластику перфорированным кожным аутотрансплантатом, остается нерешенной задачей у ожоговых хирургов нашей страны.

По-прежнему основным направлением клеточной терапии термических повреждений кожных покровов является применение культивированных фибробластов [8]. В отличие от эпителиальных клеток — кератиноцитов, при культивировании фибробластов не требуется особых условий. Кроме того, их преимуществом является относительно небольшая себестоимость. Использование культивированных in vitro фибробластов является безопасным и эффективным методом и представлено во многих обзорах [1, 4, 8—10]. Культивированные фибробласты синтезируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, стимулируют адгезию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, влияют на заживление раневых поверхностей, стимулируя ростовые процессы сохранившихся очагов эпителизации, а также способствуют более эффективному приживлению аутотрансплантатов при кожной пластике [11].

В России в 1993 г. Д.С. Саркисовым и сотрудниками Института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН [12] впервые было предложено применение дермальных фибробластов как новый и эффективный метод лечения больных с ожоговой травмой.

Результаты трудов Д.С. Саркисова предопределили развитие клеточной терапии для лечения больных с ожоговой травмой [13, 14]. Фибробласты получают из кожного биоптата дезагрегацией механическим путем или обработкой кожных образцов ферментами. Самым распространенным является ферментативный способ получения фибробластов растворами коллагеназы совместно или без трипсина. Культивирование проводится в стандартных условиях до получения монослоя, после пассирования клеточной культуры их наращивают до нужного количества.

Более перспективным для лечения дефектов кожных покровов является применение фибробластов в составе дермального эквивалента, когда клетки используются вместе с носителем [15].

Необходимость носителя для культивированных клеток при трансплантации обсуждается на протяжении длительного периода. Еще в 1980 г. C. Cuono и соавт. [15, 16] сообщили, что для достижения эффективного приживления культивированных аутокератиноцитов необходима подложка в виде аллогенной дермы. Чтобы метод Cuono был эффективным, требуется процедура состоящая из двух этапов. На первом этапе используют кожный аллографт для временного закрытия раневой поверхности. В течение 16—20 сут культивируют аутологичные клетки эпителия из небольшого по размерам кожного биоптата. Затем аутологичные кератиноциты совместно с аллогенной дермой применяют для окончательного закрытия раны. Этот метод в два этапа (аллотрансплантат и культивированные клетки) трансплантации получил признание и успешно использовался во многих больницах в конце 90-х годов XX века. Однако эта методика имеет недостатки: аллотрансплантаты кожи не являются легкодоступными; если трупная кожа отторгается раньше получения культуры аутокератиноцитов, то их использование совместно с аллогенной дермой (на основе метода Cuono) будет невозможным для последующей трансплантации [17, 18].

Научное развитие в области биологии и инженерии привело к созданию множества дермальных эквивалентов на разнообразных носителях, часть из которых стали доступны на коммерческом рынке. Большинство продуктов находятся на доклинических и клинических стадиях исследований [19, 20].

Условно представленные эквиваленты делятся на дермальные, эпидермальные и смешанного типа, в зависимости от используемого типа клеток [21].

В качества клеточного компонента в эпидермальных эквивалентах используются кератиноциты. Дермальные эквиваленты содержат в основном аллогенные фибробласты, полные кожные эквиваленты представлены кератиноцитами и фибробластами.

Кожные эквиваленты можно разделить на ацеллюлярные и клеточные продукты. Ацеллюлярные эквиваленты не содержат клетки, а состоят из полимерных соединений [10]. Они имитируют основные характеристики экстрацеллюлярного матрикса в человеческой коже при помощи предоставления некоторой формы целостности и упругости. Тем не менее эти продукты не имеют слоя эпителия и чаще всего их использование необходимо сочетать с аутотрансплантацией кожи, обычно в два этапа [10].

Наиболее востребованы ацеллюлярные эквиваленты из искусственных биоматериалов, например Integra и MatriDerm. Эквиваленты, изготовленные из естественных биоматериалов (AlloDerm и Permacol), представляют собой децеллюляризированную человеческую или свиную кожу. Эти эквиваленты имеют такие преимущества, как обладание естественной кожной проницаемостью для васкуляризации регенеративных процессов, кроме того, они поддерживают адгезию, ростовые процессы и функции многих типов клеток [22, 23].

Однако наибольший интерес вызывают разработки технологий совместного использования носителей и клеточных культур. Первое комбинированное применение было показано в 1984 г. G. Gallico и соавт. [24], которые описали применение аллоэквивалентов с последующим нанесением эпителиальных кератиноцитов больному с ожогом 97% площади тела. Однако обнаружилась проблема приживления кератиноцитов в ране при отсутствии фибробластов, а также высокая цена продуктов, что ограничило их применение при лечении больных с дефектами кожи [25, 26].

На данный момент остается актуальной разработка дермо-эпидермальных эквивалентов, имеющих как клетки эпидермиса, так и клетки дермы [21]. На коммерческом рынке представлены кожные эквиваленты, содержащие Apligraf (в составе кератиноциты и фибробласты), Dermagraft (в составе фибробласты), OrCel (в составе фибробласты и кератиноциты) и др. Эти продукты имеют высокую цену и недоступны в России.

Стоит отметить перспективность разработки аутокомпозитных эквивалентов, состоящих из коллагена и гликозаминогликановой подложки, которые содержат аутокератиноциты и фибробласты [27, 28]. Недавно немецкие ученые [29, 30] сообщили о создании тканеинженерного аутоэквивалента на основе MatriDerm, засеянного аутофибробластами и кератиноцитами, соответствующие собственной человеческой коже. Однако проблема применения аутотехнологий состоит в том, что требуется временно́й промежуток на клеточное культивирование и получение конечного эквивалента для имплантации, которого может не быть у больных с обширной ожоговой травмой [10].

Несмотря на известность и давность применения клеточной терапии в лечении раневых дефектов кожи, на сегодняшний момент применение клеточных продуктов на основе фибробластов и/или кератиноцитов не является рутинным и имеет достаточно весомые ограничения. Одна из причин связана с долгим отсутствием регламентирующих документов в нашей стране. Кроме того, эффективность клеточных технологий в медицине в большинстве научных работ доказана только косвенным путем, а полученные данные на экспериментальных животных полностью экстраполировать на человека невозможно, что также ограничивает использование клеточной терапии [31]. Излишняя настороженность у клиницистов, ограниченность публичной информации формируют у практикующих докторов либо отрицательное отношение, либо чрезмерно активное. Тем не менее научные разработки в этой области продолжаются, а поиск возможностей их применения предоставит значительные перспективы для улучшения качества оказания медицинской помощи больным с термической травмой.

В научно-исследовательском институте — Краевая клиническая больница № 1 им. С.В. Очаповского (главный врач — акад. РАН, проф. В.А. Порханов) проводится научно-исследовательская работа по изучению эффективности аутофибробластов в лечении ожоговой раны [32—36].

Актуальность клеточной терапии в комбустиологии послужила поводом для экспериментальной работы, направленной на совершенствование применения клеточной терапии в лечении пациентов с ожоговой травмой.

Экспериментальное исследование проводилось на базе ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России (ректор — д.м.н. С.Н. Алексеенко) после одобрения протоколов исследования локальным этическим комитетом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.72) и «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986). Моделью экспериментального животного послужил поросенок породы Ландрас (возраст 12 нед, масса 22 кг). Для экспериментальной работы был разработан способ моделирования кожной раны у свиней в эксперименте (заявка на выдачу патента РФ № 2019122965 от 16.07.19). Для получения децеллюляризированного матрикса использовались дермальные лоскуты свиньи толщиной 0,4 мм, размером 4×4 см. Децеллюляризация дермального матрикса проводилась по разработанному авторскому детергент-энзиматическому протоколу с последующей оценкой качества матрикса. Для подтверждения качества ацеллюлярных матриксов были выполнены гистологические исследования (окрашивание гематоксилином и эозином, флюорофором DAPI), молекулярно-биологический анализ (анализ количественного содержания остаточной ДНК), определение жизнеспособности клеток, пролеченное с помощью МТТ-теста.

Для закрытия моделированной раневой поверхности у свиньи были использованы как ацеллюлярные матриксы, так и матриксы, рецеллюляризированные дермальными фибробластами свиньи. Кроме того, оценивали приживление в динамике полнослойного кожного аутотрансплантата.

Разработанный способ моделирования кожной раны у свиньи позволил провести экспериментальную работу. В условиях операционной под наркозом в положении на правом боку после стандартной обработки операционного поля животному на левом боку наносили раскаленной металлической контактной площадкой ожоговую рану (20×15 см) необходимой глубины (IIIБ и IV стадии по классификации Вишневского). Затем электродерматомом производили некрэктомию для формирования двух ран: первой раны, у которой дном были нижние слои дермы и мозаично обнаженные участки подкожно-жировой клетчатки (проксимальнее — ближе к позвоночнику), и второй раны, у которой дном служили поверхностная фасция и мышечная ткань (рис. 1).

Через 8 сут ожоговая рана на поверхностной фасции и мышечной ткани начинала гранулировать, и на нее также выполнялось наложение 4 раневых покрытий (размером 2,5—4×2,5—4 см каждое) с условием расстояния между ними 1—2 см (рис. 4),

В дальнейшем при перевязках через 4 сут также проводились биопсии для изучения в динамике приживления раневых покрытий на ранах разной глубины. После эксперимента через 3 нед с момента первой операции в связи с оставшимися ранами животному выполняли свободную кожную аутопластику расщепленными трансплантатами толщиной 0,3—0,5 мм, взятыми на этом же боку (рис. 5).

Было отмечено, что через 7 сут после последней аутопластики наблюдалась полная эпителизация раневой поверхности (рис. 6).

При сравнительной характеристике результатов имплантации ацеллюлярных и рецеллюляризированных матриксов было обнаружено, что при применении ацеллюлярных матриксов тканевая воспалительная реакция более выражена, а в последующем формируется рубцовая ткань.

При использовании рецеллюляризированных матриксов было показано формирование полнослойной кожи под матриксами без формирования рубца.

Результаты экспериментальной работы выявили, что применение разработанного децеллюляризированного матрикса улучшает лечения ожоговых ран. В ране создается «влажная среда», вследствие чего улучшается раневая картина, предотвращается высыхание и углубление. Применение децеллюляризированного матрикса при подготовке к аутодермапластике, хирургической некрэктомии предотвращает высыхание и углубление ран, улучшает результаты аутодермопластики и приживление кожных трансплантатов.

Данные настоящего эксперимента показали эффективность разработанного способа моделирования кожной раны на крупном животном для изучения приживления полнослойного кожного аутотрансплантата, децелллюляризированных и рецеллюляризированных дермальных матриксов в динамике как на чистую, так и на гнойную хирургическую рану.

Разработанный способ моделирования ожоговой раны позволяет оценить действие биоматериалов на заживление ран различной глубины у животного, поскольку полностью предотвращает краевую эпителизацию и повторное травмирование исследуемого участка раневого дефекта. Необходимо отметить, что после проведения эксперимента при этой методике можно использовать животное для других экспериментов, вследствие выполнения аутопластики, в конце эксперимента.

В настоящее время активно развиваются технологии регенеративной медицины, одним из направлений которой является клеточная терапия [37]. Активно исследуются носители для клеток как искусственного, так и биологического происхождения, которые можно было бы использовать для имплантации in situ. Проводятся экспериментальные работы по созданию тканеинженерной полноценной кожи [38].

Совершенствование применения клеточной терапии в комбустиологии, разработки тканеинженерных конструкций на основе децеллюляризации ткани, несомненно, представляют интерес и могут оказаться полезными для закрытия кожной раневой поверхности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

C ВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Богданов С.Б. — e-mail: bogdanovsb@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-9573-4776

Каракулев А.В. — https://orcid.org/0000-0002-5477-5755

Поляков А.В. — https://orcid.org/0000-0003-1065-1352

Аладьина В.А. — https://orcid.org/0000-0002-4580-6839

Гилевич И.В. — https://orcid.org/0000-0002-9766-1811

Мелконян К.И. — https://orcid.org/0000-0003-2451-6813

Сотниченко А.С. — https://orcid.org/0000-0001-7322-0459

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Богданов С.Б., Каракулев А.В., Поляков А.В., Аладьина В.А., Гилевич И.В., Мелконян К.И., Сотниченко А.С. Совершенствование комплексного применения клеточной терапии и биологических раневых покрытий в лечении пациентов с дефектами кожных покровов. Пластическая хирургия и эстетическая медицина. 2019;4:-49. https://doi.org/10.17116/plast.hirurgia2019041

Автор, ответственный за переписку: Богданов Сергей Борисович — e-mail: bogdanovsb@mail.ru