Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.
Спорные вопросы фармакологии ботулотоксина типа A
Журнал: Пластическая хирургия и эстетическая медицина. 2021;(1): 77‑84
Прочитано: 4969 раз
Как цитировать:
Ботулинические токсины (БТ) — наиболее сильнодействующие белковые токсинаы среди бактериальных, животных, растительных и химических отравляющих веществ, являющиеся причиной развития ботулизма [1]. Вместе с тем лекарственные средства на основе БТ имеют огромные перспективы в лечении различных заболеваний. До сих пор продолжается изучение многих вопросов фармакологии БТ, имеющих большое значение в перспективе создания и лекарственных препаратов на их основе, и противоботулинических средств.
В настоящем обзоре описаны уникальные молекулярные механизмы, лежащие в основе различных этапов фармакологического действия БТ типа A (БТА), и возможные факторы, влияющие на чувствительность организма к БТ.
БТ представляет собой белок-димер с молекулярной массой 150 кДА с химической формулой C6760H10447N1743O2010S32, состоящий из двух цепей: легкой (L) и тяжелой (H). L-цепь составляет приблизительно 1/3 молекулярного веса и связана с H-цепью дисульфидной связью [2].
L-цепь является протеазой, разрушающей транспортные белки внутри клетки, она образует каталитический домен молекулы БТ. H-цепь содержит 2 домена: домен связывания соединяется с рецепторами на поверхности клетки-мишени, домен транслокации участвует в процессе транслокации L-цепи, формируя канал в мембране. Молекула БТ представляет собой диполь, она имеет электрический заряд, который уменьшается от связывающего домена к каталитическому [3]. Это играет большую роль при ориентации молекулы относительно мембраны клетки для облегчения связывания с рецепторами.
В природной среде БТ синтезируются бактериями в виде комплекса с несколькими белками: одним нетоксичным негемагглютинином (NTNHA) и несколькими гемагглютининами [1].
NTNHA имеет молекулярную массу 130 КДА и обладает очень высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей с БТ, отличаясь от молекулы БТ только отсутствием протеазного мотива. Взаимодействуя с молекулой БТ по типу «рука в перчатке», он защищает ее от агрессивного действия факторов окружающей среды, в том числе протеолитических ферментов пищеварительного тракта [4].
Существует три класса гемагглютининов: с молекулярной массой 33—35, 15—18 и 70 КДА [5]. Они напрямую не контактируют с молекулой БТ, присоединяются к NTNHA и играют роль молекулы адгезии при абсорбции токсинового комплекса.
Нетоксичный гемагглютинин и белки гемагглютинины могут образовывать с БТ большое разнообразие мультимерных комплексов, называемых комплексами БТ. Каждый из них содержит только одну молекулу БТ, которая может высвобождаться из комплекса при изменении pH среды [2].
БТ могут поступать в организм и через поврежденные, и через неповрежденные ткани. В медицинских целях препараты БТА вводят локально, преимущественно инъекционно, в максимальной близости от клеток-мишеней. Уже разработаны препараты для аппликационного применения БТА, без повреждения покровных тканей, однако пока они не прошли третью фазу клинических исследований [6, 7].
В природных условиях БТ действует системно, вызывая ботулизм, и поступает в организм в основном через неповрежденные мембраны.
В зависимости от пути поступления токсина в организм можно выделить следующие формы ботулизма: пищевой (возникающий после приема пищи, загрязненной ботулотоксином), детский (после приема пищи, загрязненной спорами бактерий), ингаляционный (после вдыхания БТ-содержащих аэрозолей), раневой (в большинстве случаев связан с применением инъекционных наркотиков), ятрогенный [8].
В природных условиях БТ, для того чтобы попасть к клеткам-мишеням, должен пересечь эпителиальные барьеры и достигнуть общей циркуляции, этот процесс называется абсорбцией.
Проникновение БТ через кишечный или легочный эпителий возможно с помощью двух механизмов: через клетку и через межклеточные контакты.
При трансцитозе (проникновении через клетку эпителия) БТ связывается ганглиозидными рецепторами на поверхности эпителиоцита и подвергается эндоцитозу (заключению в везикулу). Транспортные везикулы переносят токсин по всей длине клетки и выпускают в общую циркуляцию. При трансцитозе не происходит ни изменения структуры токсина, ни выхода его цепей в цитозоль клетки, что отличает связывание БТ с эпителиоцитами от связывания с нейронными клетками [9, 10].
Парацеллюлярный путь (через межклеточные контакты) может происходить как с помощью комплексообразующих белков, так и без них. Комплексообразующие гемагглютинины способны связываться с E-кадгерином межклеточных соединений эпителия и разрушать их, позволяя БТ проникнуть в общий кровоток [4]. Однако молекула БТ может разрушать эпителиальные барьеры и без помощи комплексообразующих белков. A. Maksymowych и соавт. (1999), F. Al-Saleem и соавт. (2012) [11, 12] экспериментально доказали, что введение эквимолярных количеств свободного БТА и комплекса БТА приводит к эквивалентным титрам БТ в общей циркуляции, одинаковой токсичности и эффективности. Однако предполагается, что гемагглютинины увеличивают скорость транспорта БТ через эпителий.
При транспорте через кишечную стенку БТ может связываться с холинергическими и серотонинергическими нейронами энтеральной (кишечной) нервной системы, находящимися в подслизистом пространстве кишки и регулирующими моторную и секреторную активность кишечника, и блокировать их. Этим объясняется появление нарушения моторики кишечника (запоры) как одного из ранних симптомов пищевого и детского ботулизма [13].
Проникнув через эпителиальный барьер, БТ попадает в кровоток и распределяется по всем отделам внеклеточной жидкости в организме, за исключением тех, которые находятся в центральной нервной системе.
K. Eisele и соавт. (2011) провели серию экспериментов [14], показывающих, что при значениях pH, близких к нейтральному (pH артериальной крови 7,37—7,43 [15, 16]), комплекс БТ диссоциирует на активный БТ и комплексообразующие белки с периодом полураспада <1 мин. С момента диссоциации токсинового комплекса комплексообразующие белки перестают иметь клиническое значение.
F. Al-Saleem и соавт. (2008) [17] экспериментально доказали, что токсин достигает общей циркуляции без явных изменений в структуре и биологической активности. Общая циркуляция действует как отсек для хранения токсина до тех пор, пока БТ не попадет к клеткам-мишеням. Во время нахождения в общей циркуляции БТ подвергается незначительной биотрансформации, не накапливается в клетках крови и остается в основном в свободном активном состоянии. Концепцию «общая циркуляция — отсек для хранения БТ» подтверждают различные исследования. R. Fagan и соавт. (2009) [18] описали наличие активного БТА в сыворотке крови человека через 11 сут после приема зараженной пищи, A. Sheth и соавт. (2008) [19] — через 25 сут, L. Delbrassinne и соавт. (2018) [20] — через 29 сут.
Из внутрисосудистого жидкого компартмента БТ попадает во внесосудистый компартмент, а затем в межклеточную жидкость. При инъекционном локальном применении в медицинских целях БТ сразу попадает во внесосудистый (или во внутрисосудистый при инъекции в сосуд) компартмент вблизи клеток-мишеней, минуя стадию абсорбции. Из межклеточного компартмента БТ должен попасть к мишени — периферическому холинергическому нервному окончанию и связаться с рецепторами на нем.
Для понимания механизма связывания БТ с рецепторами необходимо представлять, как проходит нейротрансмиссия в синапсе в норме.
Нейромедиаторы синтезируются в цитозоле нейронов и хранятся в пресинаптическом нервном окончании внутри синаптических пузырьков (везикул). В мембране синаптических пузырьков расположен протонный насос (везикулярная АТФаза), работа которого вызывает повышение концентрации протонов внутри везикулы [8]. Электрохимический градиент протонов обусловливает поступление медиатора из цитозоля в везикулу и накопление в ней. Везикулы с медиатором располагаются в цитоплазме нейрона и связываются со специализированными участками пресинаптической мембраны (активными зонами [21]) в процессе, известном как стыковка [22]. Стыковка везикул с мембраной клетки происходит только в активных зонах и регулируется большим набором транспортных белков [23].
Вследствие прохождения нервного импульса пресинаптическая мембрана аксона деполяризуется, открываются кальциевые каналы и ионы Ca2+ поступают внутрь аксона [24]. В ответ на приток Ca2+ везикула с медиатором сливается с пресинаптической мембраной в активной зоне. Эта стадия называется праймингом, в ее регуляции участвуют два интегральных мембранных белка синаптической везикулы (синаптобревин и синаптотагмин), а также два белка в пресинаптической мембране (SNAP25 и синтаксин) и цитозольные белки, включая комплексин [25—28].
Быстрое конформационное изменение везикулы с помощью регуляторных белков приводит к полному слиянию синаптической везикулы с пресинаптической мембраной и образованию поры, через которую нейромедиатор высвобождается в синаптическую щель [29].
Нейромедиатор диффундирует из нервного окончания и связывается с постсинаптическим рецептором, который запускает сигнализацию в постсинаптической клетке. В случае нейромышечного соединения ацетилхолин связывается с рецептором на плазматической мембране миоцита, что влечет за собой деполяризацию мембраны мышечной клетки. Деполяризация мембраны приводит к поступлению Ca2+ внутрь миоцита и сокращению мышцы.
Во время высвобождения нейромедиатора просвет синаптической везикулы временно открывается наружу в синаптическую щель, но позже интернализуется в нервные окончания в процессе эндоцитоза. После эндоцитоза везикула вновь наполняется нейромедиатором — и начинается следующий цикл нейротрансмиссии [30].
Связывание активных молекул БТА с клетками-мишенями происходит через рецепторы на поверхности клеток [31]. Для связывания с пресинаптической мембраной аксона необходимо взаимодействие активной молекулы БТА с комбинацией высоко- и низкоаффинных рецепторов [32]. В настоящий момент в этой комбинации описаны 3 рецептора и несколько корецепторов.
Эндоцитоз активной молекулы токсина и дальнейшие ее изменения возможны только после связывания со всей комбинацией рецепторов на поверхности аксона [5]. Связывание с одним рецептором без взаимодействия с другими не приведет к интернализации токсина. Такой многоступенчатый механизм связывания БТА с рецепторами компенсирует низкую концентрацию БТА в циркулирующих жидкостях, высокую скорость движения внеклеточной жидкости вокруг клеток и малую площадь поверхности аксонов.
Первым рецептором к БТА на поверхности аксона является полисиалоганглиозид GT1b (ПСГ).
Ганглиозиды — это гликозилированные липиды, входящие в состав мембран клеток. Хотя ганглиозиды присутствуют во всех тканях позвоночных, они более распространены в мембранах нейронов [33], где участвуют в оптимальном образовании миелина, аксон-миелиновых взаимодействиях, периферической и центральной стабильности аксонов [32].
Плотность расположения ПСГ на пресинаптической мембране велика. ПСГ организованы в микродомены вблизи активных зон пресинаптической мембраны [34]. Расположение ПСГ-рецепторов в этих зонах имеет большое значение в процессе связывания БТ с остальными рецепторами.
Олигосахаридная (БТ-связывающая часть) ПСГ выступает далеко за пределы поверхности мембраны в синаптическую щель и имеет отрицательный электрический заряд [8]. Молекула БТА представляет собой диполь, в котором домен связывания заряжен положительно [3]. Эта разница электрических зарядов домена связывания БТА и ПСГ-рецепторов (и других анионных липидов мембраны аксона) позволяет переориентировать молекулу БТА по мере продвижения его к мембране, увеличивая вероятность связывания с рецептором.
В настоящее время предполагается, что ПСГ являются начальными связующими участками, которые выводят токсин из сравнительно большого трехмерного пространства межклеточной жидкости и перемещают в двухмерное пространство плоскости мембраны [5]. Это в свою очередь необходимо для связывания токсина с последующими рецепторами. С одной стороны, связывание с ПСГ необратимо, так как БТА извлекается из межуточного вещества и закрепляется на мембране аксона. С другой стороны, на этом этапе токсин все еще подвержен воздействию и доступен для нейтрализующих антител.
Вместе с тем ПСГ являются мембранными рецепторами как для БТ, так и для ассоциированных с нейропатией человека антиганглиозидных аутоантител. Выработка аутоантител к ПСГ при нейропатии может играть роль в снижении чувствительности к БТ и возникновении резистентности [35].
Субдомен НС БТА имеет структурную гомологию с основным фактором роста фибробластов (FGF) [36]. Это сходство структуры дает возможность БТА связываться с белковым рецептором фактора роста фибробластов 3 (FGFR3b) на поверхности аксона с высокой аффинностью [37].
Однако FGFR3b тропен не только к БТА, но и ко многим факторам роста фибробластов. Причем тропность этого рецептора к факторам роста выше, чем к БТ. Нативные лиганды для FGFR3 — факторы роста FGF1, FGF2 и FGF9 — конкурируют за связывание с FGFR3 и, занимая рецепторы, способны блокировать поглощение БТА клетками [8].
Кроме того, активность рецепторов FGFR3b регулируют несколько низкоаффинных кофакторов, включая гепарансульфат, нейропилин-1, аносмин и др. [38]. Неспецифичность рецептора FGFR3, конкуренция за него между БТА и факторами роста фибробластов, влияние кофакторов на активность рецептора могут объяснить уязвимость этого рецепторного механизма и соответственно переменную чувствительность к БТ. Кроме того, при некоторых состояниях, связанных с мутацией FGFR3 (скелетные дисплазии, эпидермальные невусы, себорейный кератоз, гиперинсулинемия), может экспрессироваться дефектный FGFR3 [39—43]. Влияние мутации FGFR3 на чувствительность к БТ еще предстоит изучить.
SV2 — белковый рецептор, расположенный в мембране везикул [44] всех периферических и центральных нейронов, а также в мембранах секреторных гранул эндокринных клеток [45]. SV2 экспрессируется мембранами везикул клеток, накапливающих не только ацетилхолин, но и ГАМК, дофамин, глутамат, субстанцию Р и некоторые другие медиаторы [46].
В отличие от ПСГ-рецептора, экспрессируемого в синаптическую щель, БТА-связывающий сайт SV2-рецептора выступает в просвет синаптической везикулы и недоступен для токсина, пока везикула находится в цитозоле аксона [47]. SV2 становится доступен для БТА в момент слияния везикулы с пресинаптической мембраной и экзоцитоза ацетилхолина [48].
Таким образом, связывание БТА со всей комбинацией рецепторов происходит в активных зонах только после слияния синаптической везикулы с пресинаптической мембраной и открытия просвета везикулы в синаптическую щель, что облегчает последующий эндоцитоз БТА. После связывания с комбинацией рецепторов и эндоцитоза БТ становится недоступен влиянию нейтрализующих антител.
Связывание молекулы БТА с рецепторами приводит к рецептор-опосредованному эндоцитозу как рецепторов, так и токсина [49].
Просвет везикулы сразу после эндоцитоза имеет нейтральный pH. Протонный насос везикулярной АТФазы управляет повторным поглощением нейромедиатора [50] и накачивает протоны в синаптическую везикулу, в результате чего pH просвета везикулы постепенно уменьшается [51].
Закисление среды везикулы приводит к необратимым конформационным изменениям как H-цепи, так и L-цепи БТА. В результате этих изменений H-цепь, оставаясь связанной через рецепторы с мембраной везикулы, формирует в ней трансмембранный H-канал [52, 53], через который из везикулы в цитозоль выходит конформационно измененная L-цепь [54], после чего разрушается связывающая цепи дисульфидная связь.
Транслокация L-цепи происходит между pH 4,5 и 6. Снижение pH приводит к протонированию карбоксилатных аминокислотных остатков, входящих в состав H-цепей и L-цепей БТА. Карбоксилатные остатки располагаются на одной стороне молекулы токсина, и их протонирование приводит к значительным изменениям формы молекулы [55]. Молекула БТА положительно заряженной поверхностью взаимодействует с анионной поверхностью мембраны везикулы, образуя белково-липидный комплекс [56]. Предполагается, что L-цепь становится «расплавленной белковой глобулой», которая приобретает гидрофобность [8]. С одной стороны, гидрофобность L-цепи обеспечивает ее прохождение через мембранный канал, сформированный H-цепью. С другой стороны, при снижении pH более гидрофобной становится та поверхность молекулы, где располагается дисульфидная связь. Это обеспечивает сохранение целостности дисульфидной связи до полной транслокации L-цепи.
Для того чтобы пересечь мембрану везикулы, L-цепь должна быть дисульфидно связана с H-цепью на всем протяжении процесса транслокации [55]. Преждевременный разрыв дисульфидной связи на любой стадии до ее выхода в цитозоль прерывает транслокацию L-цепи [57].
В завершение процесса транслокации дисульфидная связь разрушается под действием системы тиоредоксинредуктаза (TrxR)—тиоредоксин (Trx), высвобождая L-цепь для экспрессии ее каталитической активности в цитозоле [58].
Система TrxR—Trx — основная окислительно-восстановительная система клетки. TrxR и Trx являются белками цитозольной стороны мембраны везикулы, и их ингибирование может блокировать развитие эффекта БТА на той стадии, где токсин уже недоступен действию нейтрализующих антител [59]. G. Zanetti и соавт. (2015) в экспериментах in vitro показали, что ингибиторы ферментной пары TrxR—Trx препятствуют протеазной активности L-цепи всех известных серотипов БТ в культивируемых нейронах, а in vivo предотвращают токсин-индуцированный паралич у мышей независимо от серотипа БТ [60].
В модели жизненного цикла разрыв дисульфидной связи означает конец внутриклеточного существования интактной активной молекулы БТА (голотоксина). Даже если бы L-цепь или H-цепь были экспортированы из клетки, ни одна из них сама по себе не могла бы нарушить функцию клетки. Только голотоксин обладает способностью проходить множество стадий, которые завершаются блокадой передачи [61]. С другой стороны, конформационные изменения, связанные с pH-индуцированной транслокацией L-цепи в цитозоль, создают «ловушку», которая делает невозможной как ретротранслокацию в эндосому, так и возвращение активной молекулы токсина во внешнюю среду клетки [5].
Измененная L-цепь через H-канал выходит в цитозоль нейрона, где действует как металлопротеаза. Она ферментативно расщепляет девять аминокислот из C-конца растворимого N-этилмалеимидочувствительного рецептора прикрепления фактора (SNARE) белка SNAP25 (SNAP25206), в результате чего образуется SNAP25197 [62, 63]. Интактный SNAP25 необходим для прикрепления везикулы с медиатором и последующего высвобождения нейротрансмиттера, также он непосредственно участвует в регуляции работы Ca-каналов пресинаптической мембраны [64]. Расщепление SNAP25 нарушает экзоцитоз медиаторов, вызывая блокаду передачи нервного импульса [65].
Синаптическая активность очень чувствительна к расщеплению минимального количества SNAP25. Выдвигаются гипотезы, что SNAP25 в цитозоле нейронов существует в виде различных пулов и лишь небольшое количество SNAP25 активно участвует в процессе экзоцитоза и доступно действию L-протеазы [66]. Это подтверждают эксперименты, показывающие, что расщепление 10—15% от общего внутриклеточного пула SNAP25 достаточно для полной блокады высвобождения нейромедиатора [67—69]. Расщепление L-протеазой всего 2—3% пула SNAP25 приводит к блокированию миниатюрных постсинаптических потенциалов клеток (слабой деполяризации постсинаптических мембран в состоянии нейромышечного покоя) [70].
Вместе с тем белок SNAP25197, продукт протеолиза SNAP25, самостоятельно выступает ингибитором экзоцитоза [71]. F. Meunier и соавт. [72] описали, что SNAP25197 способен долгое время сохраняться в цитозоле в составе непроизводительного комплекса SNARE, увеличивая продолжительность действия БТА. Тогда как удаление нескольких аминокислот из SNAP25197 приводит быстрому восстановлению экзоцитоза.
Цинк необходим для каталитической активности L-цепи. Одна молекула ботулинического голотоксина содержит один атом цинка, удерживаемый цинксвязывающей аминокислотной последовательностью L-цепи, и это связывание обратимо [73].
Закисление везикулы вызывает протонирование цинксвязывающих участков молекулы БТ. При транслокации происходит денатурация L-цепи, при которой теряется целостность хелатного сайта. Это приводит к диссоциации связанного цинка и его присоединению к пулу цитозольного цинка.
L. Simpson и соавт. [74] в эксперименте in vitro установили, что удаление цинка из активной молекулы БТ приводило к потере каталитической активности L-цепи в бесклеточных препаратах, но сохранению активности в интактных нервно-мышечных соединениях вследствие того, что интернализованный токсин связывал цитозольный цинк. Таким образом, цинк, который удерживается голотоксином (неповрежденной активной молекулой), не является тем же самым цинком, который связан с каталитически активной L-цепью. L-цепь связывает цитозольный цинк.
Основной мишенью БТА являются периферические нейроны, где БТ ингибирует высвобождение ацетилхолина [75].
Большое количество исследований, проведенных на клетках, показало, что БТА не только блокирует высвобождение ацетилхолина, но и предотвращает высвобождение многих других нейромедиаторов, если они накапливаются и хранятся в везикулах [32]. К ним относятся адреналин, норадреналин, дофамин [76, 77], глутамат [78], глицин [79], серотонин [80], субстанция Р [81] и др. Исходя из этого, БТ должен рассматриваться не как специфический блокатор выделения ацетилхолина, а как блокатор экзоцитоза различных медиаторов, что имеет огромные перспективы в лечении и профилактике многих заболеваний.
Дальнейшее изучение уникальных механизмов фармакологии БТ открывает перспективы поиска возможностей влиять на его действие: пролонгировать или уменьшать длительность эффекта, повышать или понижать чувствительность к БТ определенных групп пациентов, а также поможет разработать протоколы оптимального сочетания применения БТ с различными видами эстетических процедур. Более глубокое понимание множественных аспектов не только нейрональной селективности БТ, но и взаимодействия БТА с ненейрональными клетками позволит найти новые направления терапевтического применения препаратов на основе БТ в разных сферах медицины.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Литература / References:
Подтверждение e-mail
На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.
Подтверждение e-mail
Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.
