Значительное возрастание числа людей с избыточной массой тела становится серьезной социальной проблемой, поскольку ожирение ассоциировано со многими хроническими заболеваниями. По данным ВОЗ, в мире насчитывается более 300 млн человек с ожирением (http://www.int/nut/obs.htm), а в некоторых странах их количество превышает 30%. Исследование, проведенное в США [1] в 2003—2006 гг., выявило избыточную массу тела (ИМТ > 25 кг/м²) у 66% населения и явное ожирение (ИМТ >30 кг/м²) — у 32%. Сходная картина наблюдается в других регионах, что позволило ВОЗ объявить об эпидемии ожирения, которое становится более серьезной проблемой, чем опасные инфекционные заболевания или голодание.

Чрезмерное накопление жировых запасов вызывается избыточным потреблением калорий, которое превосходит их расходование. В результате поглощаемая в большом количестве пища не используется для поддержания жизни, а запасается в форме жировых отложений. Ожирение — полифакторное заболевание, и изучение его причин становится актуальной проблемой. Накопление жиров в подкожной и абдоминальной области сопровождается изменением экспрессии генов, которые кодируют белки, регулирующие энергетический обмен. К таким белкам относятся некоторые гормоны, рецепторы и переносчики гормональных сигналов. Веществами, снижающими потребление пищи и препятствующими ожирению, являются кокаин- и амфетамин-регулируемый транскрипт (CART) [2], лептин, холецистокинин, панкреатический пептид (РР), ресничный нейротропный фактор (CNTF), глюкагоноподобный пептид 1 (ГПП-1), пептид YY, нейромедин S и др. [3], а стимуляторами аппетита — грелин, нейропептид Y (НП-Y), белок, родственный белку Агути (БРБА), орексины, галаниноподобный пептид, рецептор эндогенных каннабиногидов, рецептор, активируемый пролифератором пероксисом γ (PPARγ) и др. [3]. Мутации и нарушения экспрессии генов белков первой группы индуцируют ожирение. Поскольку каждый из белков, помимо регуляции потребления пищи, выполняет другие функции, индуцируемое мутациями ожирение сопровождается различными формами патологии, характер которых определяется особенностями биологического действия белков, кодируемых мутантными генами.

Молекулярные механизмы участия многих генов и белков в регуляции пищевого поведения пока находятся в стадии изучения, и детали их функционирования остаются неясными. В настоящей статье основное внимание уделяется молекулярным механизмам действия лептина и переносчиков его сигналов, которые исследованы более детально и могут служить примером изучения роли других генов и белков в регуляции энергетического баланса. Ключевую роль в этом процессе играют последовательные активации экспрессии генов: LEP→LEPR→POMC→ MC4R.

Лептин относится к группе гормонов подкожной жировой клетчатки и регулирует многие физиологические функции. Он связывается в нейронах гипоталамуса и других тканях с рецептором лептина (LEPR), который по химической структуре и механизмам функционирования относится к группе рецепторов гормона роста (ГР), пролактина, эритропоэтина и многих цитокинов и активирует экспрессию различных генов, и в том числе гена проопиомеланокортина (POMC). Из ПОМК после протеолитического расщепления освобождаются α-, β- и γ-меланокортины (МСГ) — проводники гормонального сигнала лептина. На постсинаптической мембране нейронов МСГ взаимодействуют с рецепторами МК3Р и рецепторами меланокортинов (МК4Р) и вызывают снижение чувства голода, активируют использование жиров в энергетическом обмене и тормозят избыточное накопление жировых запасов [4]. Мутации в генах LEP, LEPR, POMC и MC4R нарушают их экспрессию, создают дефицит кодируемых белков, увеличивают потребление пищи, нарушают регуляцию липидного обмена и вызывают ожирение.

К настоящему времени у людей идентифицировано меньше всего мутаций в LEP, больше — в LEPR, значительно больше — в POMC и больше всего (более 150 мутаций) — в MC4R. Мутации в LEP и LEPR являются рецессивными и индуцируют ожирение только в гомозиготном состоянии. Мутации в POMC и MC4R вызывают ожирение различной тяжести у гомозигот и ассоциированы с повышенным накоплением жировых запасов у гетерозигот.

Сегодня известна серия мутаций в LEP. Первая мутация g.15384delG идентифицирована в 1997 г. у детей — выходцев из Пакистана. Она вызывает сдвиг рамки считывания G133fsX15 и исключает из синтезируемого белка карбоксильный участок с Cys на С-конце [5] (рис. 1).

Лечение детей с мутацией g.15384delG рекомбинантным лептином быстро нормализует нарушенные функции [6]. Однако при проведении подобной терапии возникает проблема. Поскольку мутация c преждевременным стоп-кодоном ликвидирует лептин, то в период индивидуального развития он, по всей вероятности, не представлялся иммунной системе в качестве собственного антигена, и к вводимому гормону быстро вырабатываются антитела. Дозу лептина приходится увеличивать в несколько раз для поддержания нормального энергетического баланса в течение 1—4 лет [6]. Пока отсутствуют сообщения о более поздних результатах лечения таких пациентов лептином.

Мутация р.G133fsX15 в LEP довольно распространена в Пакистане среди детей с ранним началом тяжелого ожирения. В одном исследовании [7] она обозначена c.398delG, а в другом – G133_VfsX14 [8], и в обоих случаях указывает на делецию G в кодоне Gly133 (GGG) в LEP. У выходцев из других стран подобная мутация не описана.

Вторая замена с.313С>Т (p.R105W) в LEP выявлена у взрослых выходцев из Турции [9]. Она переводит CGG(Arg) в TGG(Trp). Раньше замена с.313С>Т в Lep обнаружена у мышей ob/ob, но у экспериментальных животных она превращает CGА(Arg) в терминирующий кодон TGA (p.R105X) [10], который укорачивает белок до 104 а.о. (вместо 146 в активном лептине) и, вероятно, лишает его биологической активности. В результате у мышей развивается ожирение, бесплодие, поликистоз яичников, сахарный диабет 2-го типа (СД2) и нарушается иммунитет. В отличие от грызунов, у человека замена c.313С>Т не укорачивает гормон, но задерживает его в клетке и тормозит секрецию (показано в экспериментах с трансфекцией COS-1 клеток мутантной сДНК) [9]. Можно допустить, что замена p.R105W нарушает фолдинг и процессинг мутантного лептина в эндоплазматическом ретикулуме и вызывает дефицит гормона в циркуляции. Пациенты демонстрируют более легкую патологию, чем мыши ob/ob с заменой с.313С>Т или дети с g.1584delG в гене лептина. Многие носители мутации p.R105W в гомозиготном состоянии умирают в детстве, однако некоторые доживают до зрелого возраста. Вместе с ожирением у них развиваются симптомы резистентности к инсулину (чрезмерное повышение концентрации инсулина натощак и после приема пищи) и задержка полового развития [11]. Вместе с тем у одной женщины торможение полового развития спонтанно компенсировалось без дополнительного вмешательства, и менструации у нее появились с некоторыми отклонениями от нормы после продолжительной задержки в течение 20 лет [11], что свидетельствует о мягкой форме нарушения физиологических функций у пациентов с мутацией p.R105W.

Лечение взрослых пациентов рекомбинантным лептином в течение многих лет поддерживает сниженную массу тела и нормализует нарушенные функции [12, 13]. Пока отсутствуют указания о возникновении у пациентов антител к лептину, поскольку уже более 10 лет при ежедневных инъекциях гормона у них сохраняется ИМТ на верхней границе нормы, уменьшаются симптомы гипогонадизма и снижается резистентность к инсулину [13, 14]. Возможно, лептин с мутацией p.R105W, хотя и задерживается в адипоцитах, но в период роста и развития пациентов попадает в циркуляцию и представляется иммунной системе в качестве собственного антигена.

После 18 мес регулярных инъекций лептина масса тела пациентов снижается в 2 раза (со 140 кг и более до 70 кг). У женщины, страдавшей СД2, концентрации глюкозы, инсулина и гликированного гемоглобина уменьшались до нормальных значений, и все симптомы СД2 исчезли. У мужчины, страдавшего гипогонадизмом, появились вторичные половые признаки с увеличением уровня циркулирующих гонадотропинов и тестостерона [12]. Регулярные инъекции лептина поддерживают в течение более 8 лет почти нормальный ИМТ у носителей мутации R105W в гомозиготном состоянии [13]. Результаты этих исследований воспроизводят данные, полученные ранее на мышах ob/ob, введение которым лептина тормозит потребление пищи, уменьшает жировые запасы, нормализует энергетический обмен, снижает уровни сахара и инсулина в крови, восстанавливает репродуктивную функцию и корригирует другие физиологические нарушения [4, 15].

Авторы продолжают публиковать результаты обследования людей с мутацией p.R105W, которая у них получила неожиданное обозначение р.С105Т и трансформировалась в замену Cys105Thr в лептине [12—14]. Мутация p.R105W была идентифицирована в 1998 г. группой французских ученых в сотрудничестве с коллегами из Германии и Турции [9]. Замена нуклеотида С на Т в триплете CGG, кодирующем Arg, превращает его в триплет TGG, кодирующий Trp. Однако специалисты в области молекулярных исследований в последующем отошли от изучения гена LEP, и замена нуклеотида С на Т в ДНК стала интерпретироваться клиницистами как С105Т и превратилась из миссенс-мутации Arg105Trp в замену Cys105Thr в кодируемом белке. Ошибочно Cys105Thr приводится в 2004 г. в PNAS [12], повторяется в течение многих лет в других публикациях [13] и цитируется другими авторами. Любопытно, что рецензенты и специалисты, читавшие работы, не намекнули авторам, что мутации Сys105Thr в лептине не существует. Позднее она иногда меняется на Arg105Trp, но в резюме и в тексте сохраняется как С105Т [16]. По аналогии с результатами исследований мышей ob/ob, авторы полагают, что у людей мутация с.313C→T в LEP также укорачивает синтезируемый белок, однако данные электрофореза [9] такое заключение не подтверждают.

Третья мутация в LEP g.15409C>G (p.S141C) выявлена в наших исследованиях у жителей горного аула Караул в Туркменистане [17]. Замена цитозина C422 (пиримидина) на более крупный гуанин (пурин), по всей вероятности, существенно изменяет конформационные свойства мутантной цепочки ДНК. Поэтому ее электрофоретическая подвижность в SDS ПААГ (при замене только одного нуклеотида) уменьшается в 3 раза по сравнению с ДНК дикого типа (показано методом SSCP) [17]. Мутация p.S141C обнаружена в семьях, где примерно 1/4 детей страдают ожирением, что характерно для аутосомно-рецессивного типа наследования, присущего мутациям в LEP. Такие пациенты могли бы стать объектами более глубокого изучения, однако из-за трудностей организационного характера ассоциацию мутации р.S141C с нарушением липидного обмена пока не удается подтвердить клиническими исследованиями. Несмотря на отсутствие таких данных, можно с уверенностью предсказать, что появление третьего непарного остатка Cys внутри дисульфидной петли между остатками Cys117 и Cys167 (см. рис. 1) должно нарушать правильное замыкание единственного S—S мостика в молекуле синтезируемого гормона и тормозить его процессинг. В результате может тормозиться фолдинг, продвижение белка из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и последующая его секреция. Мутация p.S141C создает дефицит лептина, возможно, не такой суровый, как мутации р.G133fsX15 у человека [5] или p.R105X у мышей ob/ob [10]. Поэтому пациенты с заменой g.15409C>G (p.S422C) в LEP могли бы быть объектами интересных клинических исследований эффективности их лечения экзогенным лептином и влияния гормона на различные формы патологии, развивающиеся у человека при ожирении.

Четвертая мутация с.309С>А (p.N103K) в гомозиготном состоянии (авторы квалифицируют ее как третью) идентифицирована в Египте у 2 детей в семье, где родители являются кузенами — носителями мутации в гетерозиготном состоянии. Дети сразу после рождения потребляют повышенные количества пищи с ранним началом тяжелого ожирения и ИМТ=51 и 45 кг/м² соответственно (при норме ИМТ≤25 кг/м²) [18]. Низкий уровень циркулирующего лептина вызывает ожирение, которое сочетается с увеличением инсулина в 2 раза по сравнению с верхней границей нормы при нормальной концентрации сахара. Это указывает на раннее развитие резистентности к инсулину, которая в раннем возрасте компенсируется повышением его секреции. Авторы не изучали распределение лептина К103 между клетками и инкубационной средой in vitro. Однако по аналогии с заменой p.R105W [5] можно полагать, что мутация p.N103K также задерживает синтезируемый белок в клетках и тормозит секрецию.

Зрелый лептин (без сигнального пептида) с заменой N82 К получен путем экспрессии мутантной сДНК в Escherichia coli [19]. Циркулярный дихроизм выявляет сходный фолдинг и идентичную вторичную структуру мутантного белка лептину дикого типа. Однако связывание лептина K82 с LEPR и его действие in vitro снижаются на порядки, что свидетельствует о значительном уменьшении не только секреции, но и биологической активности гормона [18, 19].

Недавно среди некоторых детей с ранним началом тяжелого ожирения в Пакистане выявлены новые мутации — c.481_482delCT, c.104_106delTCA [7] и 135del 3bp(delIle45) в LEP [8]. Они ассоциированы с резким увеличением потребления пищи сразу после рождения и повышенным накоплением жировых запасов.

Перечисленные мутации исследованы у выходцев из Пакистана, Турции, Туркменистана и Египта, где имеют место частые близкородственные браки. Среди европейцев первая мутация с.207Т>С (р.L72S) в LEP обнаружена в гомозиготном состоянии у девочки 14 лет в семье, где оба родителя являются гетерозиготами (в родословной без близкородственных браков). У пациентки имеется умеренное ожирение (ИМТ=31,5 кг/м²), что, вероятно, обусловлено постоянным ограниченным потреблением пищи [20]. Как и p.R105W, мутация p.L72S задерживает белок в клетках HEK293 после трансфекции мутантной сДНК и тормозит поступление синтезируемого продукта в среду. Фенотип и нарушения физиологических функций имеют много общего с таковым у носителей мутации p.R105W [9] и проявляются гипогонадизмом со снижением уровней ЛГ и ФСГ и повышением концентрации инсулина как до, так и после стимуляции глюкозой. Сахар крови поддерживается в норме, вероятно, вследствие повышенной секреции инсулина β-клетками.

Белком, воспринимающим действие лептина, является рецептор LEPR. Первая мутация в LEPR была идентифицирована в форме замены G→А в донорном сайте сплайсинга экзона 16 [21]. В результате при экспрессии LEPR пропускается экзон 16 и синтезируется укороченный рецептор, который не встраивается в клеточную мембрану и не проводит гормональный сигнал. В некоторых публикациях мутация G→A в экзоне 16 со ссылкой на оригинальную статью [9] обозначается как замена G/T в экзоне 13, что, по всей вероятности, является заблуждением [6]. У носителей мутации в LEPR в гомозиготном состоянии развивается тяжелое ожирение, поскольку лептин теряет способность выполнять биологическую функцию. Нарушение липидного обмена, вызванное отсутствием LEPR, сопровождается гипогонадизмом, задержкой полового развития, снижением секреции ГР, ТТГ и др., что свидетельствует о торможении нормального функционирования передней доли гипофиза.

Многолетние наблюдения за пациенткой с заменой G→A в донорном сайте сплайсинга в LEPR дали интересные результаты. Ожирение у нее постоянно прогрессировало, масса тела достигала 220 кг (ИМТ=81кг/м²), а после операции на желудочно-кишечном тракте снизилась до 170 кг (ИМТ=62 кг/м²). Несмотря на слабое падение запасов жира, многие нарушения, развивающиеся при ожирении, такие как сахарный диабет, гипертония и др., у женщины смягчились или почти исчезли. Гипогонадизм в раннем возрасте не блокировал у нее наступление пубертата, и после достижения половой зрелости она родила дочь с нормальной массой тела (кесарево сечение) [22]. Поэтому отсутствие активного рецептора лептина не обязательно препятствует воспроизведению потомства, но тормозит наступление фертильности. Длительное время выявленная мутация G→A оставалась единственной, полностью нарушающей экспрессию LEPR и блокирующей синтез активного рецептора у человека.

Прогресс в изучении мутаций в LEPR достигнут в исследованиях научных групп S. O’Rahilly и I. Farooqi [23, 24]. В большой выборке пациентов с ранним началом тяжелого ожирения выявлена серия мутаций в LEPR на отрезке, кодирующем внеклеточный домен [23]. Делеции 4 и 11 п.о. в 5´-конце кодирующего участка вызывают сдвиги рамок считывания и, как нонсенс-мутация p.W31X вблизи N-конца, ликвидируют рецептор. Делеция 66 п.о. повреждает один из цитокиновых доменов (CRH domains 1 и 2) и в гомозиготном состоянии ассоциирована с ожирением. Сходным эффектом обладает составная гетерозиготная мутация – делеция 1 п.о. в кодоне 15/миссенс-мутация p.R612H.

Делеции 1, 4 и 11 п.о. в 5´-конце сДНК и нонсенс мутация p.W31X блокируют экспрессию гена.

В гомозиготном состоянии они ликвидируют рецептор. Более разнообразное действие оказывают миссенс-мутации A409E, W664R, H684P и R612H в LEPR, исследованные на клетках НЕК293 после их трансфекции различными векторами [23,24]. Замена А409Е не тормозит встраивание рецептора в мембрану и не изменяет связывание LEPR с лигандом, а мутации R612H, W664R и H684P сочетаются со снижением связывания рецептора с лептином. Однако такое снижение в культуре клеток, скорее, обусловлено не падением аффинности, а уменьшением количества рецептора на мембране. Мутации A409E, W664R, H684P блокируют индуцируемое лептином Tyr-фосфорилирование JAK2, STAT3 и ERK1/2 (проводников гормонального сигнала лептина), а R612H значительно снижает фосфорилирование JAK2 и STAT3, и такое снижение не компенсируется повышением концентрации лептина [24]. Мутации R612H, W664R и H684P тормозят встраивание LEPR в мембрану, тогда как рецептор с заменой А409Е, хотя нормально фиксируется на поверхности клеток, но не проводит гормональный сигнал [24].

Во внеклеточном участке LEPR идентифицировано несколько доменов, выполняющих разные функции. Два цитокиновых домена (CRH domains) участвуют во взаимодействии рецептора с лептином, несколько фибронектиновых доменов (Fibronectin III domains — FN-III domains) определяют фолдинг и встраивание рецептора в мембрану, а иммуноглобулиновый домен (Ig-like domain) участвует в проведении гормонального сигнала [23, 25].

На основании существования в LEPR нескольких доменов предложена гексамерная модель образования активного комплекса лептин/рецептор, который проводит гормональный сигнал лептина [23, 25]. В соответствии с такой моделью, два сайта в молекуле лептина соединяются с CRH2, доменами в двух молекулах рецептора и формируют неактивный триплет LEPR/LEP/LEPR, скорость образования которого определяется аффинностью связывания рецептора с лигандом. Благодаря наличию в молекуле лептина третьего сайта связывания c Ig-like доменом в LEPR, два триплета LEPR/LEP/LEPR объединяются в гексамер, активируются и проводят гормональный сигнал [24, 25]. Мутации W664R и H684P располагаются в FN III, домене и почти в 2 раза снижают процессинг и встраивание рецептора в мембрану. Мутация R612H в другом FN III-домене в меньшей степени тормозит процессинг и встраивание в мембрану, а закрепленный на мембране рецептор сохраняет, хотя и сниженную, способность проводить гормональный сигнал. Мутация A409E локализуется в Ig-like-домене. Она не изменяет структуры CRH и FN III-доменов, участвующих в процессинге синтезируемого рецептора и формировании неактивного триплета LEPR/LEP/LEPR. Поэтому замена А409Е не влияет на фолдинг и встраивание рецептора в мембрану и не снижает связывание с лигандом, но, поскольку она локализуется в Ig-like-домене, то нарушает соединение двух триплетов в гексамер и тормозит проведение гормонального сигнала [24]. Анализ полученных данных позволил сделать заключение, что миссенс-мутации в LEPR в основном повреждают эффективный фолдинг и встраивание рецептора в мембрану и, в меньшей степени, снижают связывание с лигандом [24].

Помимо перечисленных мутаций в LEPR, у человека исследованы новые мутации. Гомозиготная замена р.P316T выявлена у двух кузенов (мальчика и девочки 2 лет), у которых обе пары родителей являются гетерозиготами и родственниками в одной родословной [26]. Дети демонстрируют раннее начало тяжелого ожирения с повторяющимися респираторными инфекциями и повышенным уровнем циркулирующего лептина. Удаление Pro316 из лептинового рецептора может повышать конформационную мобильность белка, а появление Thr — предрасполагать к формированию альтернативных водородных связей, что должно препятствовать фолдингу и встраиванию рецептора в мембрану. В гомозиготном состоянии мутация серьезно тормозит нормальное функционирование рецептора лептина, и дети с мутацией в LEPR практически теряют чувство сытости и потребляют пищу днем и ночью. Мутация p.P316T локализуется в Ig-like-домене, между доменами CRH1 и 2 и, по всей вероятности, нарушает как фолдинг, так и проведение гормонального сигнала, оказывая сильное негативное влияние на функцию рецептора.

Недавно выявлена двойная миссенс-мутация P316T:W646C в LEPR. В гомозиготном состоянии она инактивирует рецептор, и у девочки 6 лет сочетается с резким возрастанием аппетита сразу после рождения и тяжелым ожирением [27]. Новая замена W646C, локализующаяся в FN-III-домене, индуцирует появление нового остатка Cys и способна усиливать отрицательное влияние известной мутации P316T в Ig-like-домене и в комплексе оказывать более сильное негативное влияние на экспрессию гена и функцию рецептора, чем одна замена P316T.

В больших выборках пациентов с тяжелым ожирением мутации в LEPR обнаруживаются у 3% и сопровождаются задержкой полового развития и резистентностью к инсулину [23]. Взрослые женщины страдают гипогонадизмом и имеют сниженные уровни ЛГ и ФСГ. У 3 из них менструации не наступают после достижения 20 лет, а у женщин в возрасте 30—55 лет проходят нерегулярно. Большинство субъектов демонстрируют нормальный уровень глюкозы, однако почти у всех концентрация инсулина в крови повышена, и 2 пожилых пациента страдают СД2. Дети с мутациями в LEPR чаще болеют инфекционными заболеваниями, чем дети с LEPR дикого типа, и некоторые из них умирают от острых респираторных инфекций, что свидетельствует о снижении иммунитета. Т-клетки у них слабее реагируют повышением пролиферации в ответ на стимулирующие воздействия. Пациенты сохраняют нормальный рост, и ГР у них секретируется пульсирующим образом, однако у взрослых снижены размеры тела, вероятно, вследствие отсутствия ускорения роста в период пубертата. У них отсутствуют признаки снижения энергетического обмена, а уровни ТТГ и тироидных гормонов колеблются в нормальных пределах.

В целом для пациентов с абсолютным дефицитом LEPR характерны менее тяжелые нарушения физиологических функций, чем у людей с врожденным отсутствием лептина, вызванным гомозиготными мутациями в LEP. Они потребляют меньше пищи, имеют более низкий ИМТ, и среди них встречаются дети и взрослые [23]. Полученные результаты позволяют подозревать существование других проводников гормональных сигналов лептина помимо LEPR, которые проявляют особенно высокую активность при повышении уровня гормона, обычно наблюдаемого при ожирении [23]. Родственники пациентов с ожирением — носители мутации в LEPR в гетерозиготном состоянии — остаются практически здоровыми, правда, с некоторым увеличением процента жира в теле по сравнению с гомозиготами LEPR дикого типа. Более легкая патология у пациентов с мутациями в LEPR подтверждается исследованием женщины с дефицитом рецептора лептина, которая, несмотря на задержку полового развития, родила дочь [22].

Редкое выявление мутаций в LEP и LEPR, вероятно, обусловлено снижением фертильности и повышением восприимчивости к инфекциям, что уменьшает передачу таких мутаций последующим поколениям и закрепление в популяции. Поэтому низкая частота мутаций в LEP и LEPR может быть обусловлена естественным отбором, подобно мутациям, нарушающим функцию инсулина [28].

В гене POMC исследовано больше мутаций, чем в LEP и LEPR. Среди них мутации в гомозиготном состоянии: g.3804C>A [29], g.6906delC [30] и g.6922insC [31] и компаунд гетерозиготные мутации g.7134delG/g.7013G→T, g.6996del/g.6851A→T и g.3804C→ A/g.7100insGG [29]. Мутации со сдвигом рамки считывания индуцируют терминирующие кодоны и блокируют экспрессию POMC, а миссенс-мутации изменяют структуру кодируемого белка. Они ассоциированы с тяжелым ожирением, сопровождающимся нарушением других физиологических функций. ПОМК является предшественником не только меланокортинов, которые синтезируются в гипоталамусе и вызывают снижение потребления пищи. Помимо меланокортинов в передней доле гипофиза из ПОМК освобождается АКТГ — гормон, контролирующий нормальное развитие и последующее функционирование коры надпочечников. Поэтому тяжелое ожирение, вызываемое полным отсутствием ПОМК, сочетается с атрофией коры надпочечников и делает пациентов маложизнеспособными. Мутации, вызывающие блокаду экспрессии POMC, пока выявляются в гомозиготном или компаунд гетерозиготном состоянии только у детей и подростков, взрослые пациенты с такими мутациями не описаны.

Недавно исследованы новые гомозиготные мутации в POMC. Нонсенс-мутация p.R86X ликвидирует ПОМК и сочетается у мальчика с ранним тяжелым ожирением и гипокортицизмом [32]. Гомозиготная мутация р.Y77X выявлена у девочки на втором году жизни. Она также блокирует синтез всех активных пептидов ПОМК и ассоциирована с быстрым возрастанием веса тела, резким дефицитом АКТГ и кортикостероидов, а также с другими нарушениями: гипогликемией, гипонатриемией, эпизодами лихорадки и вялостью [33] (рис. 2).

Более жизнеспособными оказываются носители мутаций в POMC в гетерозиготном состоянии, у которых также развивается тяжелое ожирение. Одна из таких мутаций выявлена в форме гаплотипа p.202insRA/p.E206X у дочери и матери в Германии. В белке без сигнального пептида она обозначена как p.176insRA/p.E180X (см. рис. 2) [34]. Через 4 года идентичный гаплотип обнаружен в наших исследованиях у 8 пациентов c ожирением, из которых 5 входят в случайную выборку [35, 36]. Поскольку подобная мутация пока не выявлена у выходцев из других регионов мира, несмотря на значительный объем проводимых исследований, можно предполагать потенциальный регион ее возникновения. Большое количество мутаций в POMC идентифицировано вблизи или непосредственно в нуклеотидной последовательности, кодирующей β-МСГ, включая гаплотип p.202insRA/p.E206X [34—36]. Кроме нее, в ПОМК выявлена замена Y221C в структуре β-МСГ [37, 38]. Tyr221 является консервативным в ПОМК разных видов животных и человека, и замена его на Cys значительно снижает связывание β-МСГ с рецептором МК4Р и уменьшает биологическую активность медиатора, определяемую по стимуляции образования цАМФ в культуре клеток [37, 38]. Одной из возможных причин нарушения функции β-МСГ, вызываемого мутацией Y221C, может быть появление непарного остатка Cys вблизи активного центра HFRW, изменяющая эффективность проведения гормонального сигнала [37]. С более высокой частотой мутация p.Y221C в гетерозиготном состоянии выявляется у пациентов с ожирением, но обнаруживается также у здоровых людей.

Первая мутация в POMC, изменяющая аминокислотную последовательность α-МСГ, была идентифицирована в наших исследованиях в 2002 г. [35]. Мутация F144L вызывает замену Phe на Leu в активном центре HFRW α-МСГ (см. рис. 2). Длительное время 4 носителя такой мутации в гетерозиготном состоянии были единственными представителями пациентов с ожирением, вызываемым изменением структуры α-МСГ. Только через 6 лет появляется публикация о такой же мутации в гетерозиготном состоянии у девочки и ее отца во Франции [39]; было показано, что α-МСГ с заменой F144L теряет биологическую активность и после связывания с рецептором МК4Р не стимулирует синтез цАМФ в культуре клеток.

У пациентов с ожирением идентифицирована мутация p.R236G, которая ликвидирует дуплет основных аминокислот между β-МСГ и β-эндорфином в структуре ПОМК [40]. Она нарушает протеолитическое расщепление ПОМК с образованием β-МСГ и β-эндорфина, которые остаются соединенными друг с другом. Объединенный пептид сохраняет способность связываться с МК4Р с тем же сродством, что и β-МСГ, но не активирует рецептор и тормозит действие на него активных меланокортинов.

Поскольку биологически активные пептиды освобождаются из ПОМК под влиянием протеолитических ферментов РС1/3 и РС2 [41], можно было полагать, что пространственная структура ПОМК не имеет существенного значения для выполнения его физиологической функции. Однако такое предположение опровергается исследованием мутаций на N-конце ПОМК вдали от биологически активных пептидов. Две мутации в пептидной шпильке, образуемой двумя дисульфидными мостиками на N-конце ПОМК (см. рис. 2), ассоциированы у человека с ожирением [42]. Мутация C28F ликвидирует один из парных остатков Cys, который формирует дисульфидный мостик, возможно, участвующий в фолдинге ПОМК. Поскольку, в отличие от мышей, ПОМК человека имеет дополнительный (пятый) остаток Cys113, то ликвидация Cys28 может способствовать формированию альтернативного дисульфидного мостика между остатками Cys50 и Cys113 и полностью запутывать корректный фолдинг и процессинг синтезируемого белка с освобождением разных МСГ [29—31]. Вторая мутация L35F на N-конце ПОМК оказывает сходное, но более слабое действие и ассоциирована с более легким ожирением [42]. Обе мутации задерживают ПОМК в эндоплазматическом ретикулуме и препятствуют его поступлению в секреторные гранулы, где из него освобождаются биологически активные пептиды [42].

В результате возникает дефицит меланокортинов и развивается ожирение.

У женщины с ожирением в позднем возрасте выявлена первая, локализующаяся в сигнальном пептиде ПОМК, миссенс-мутация p.A15G. В гетерозиготном состоянии она ассоциирована с ожирением, СД2, гипертонией и сердечно-сосудистой патологией. Мутация p.A15G не блокирует экспрессию POMC, и мРНК ПОМК с такой мутацией сохраняет нормальную длину, однако замена p.A15G в сигнальном пептиде, вероятно, существенно изменяет вторичную структуру и фолдинг РНК, что тормозит ее трансляцию и синтез кодируемого активного белкового предшественника [43]

Таким образом, иногда мутации, вызывающие дефицит лептина или ПОМК, тормозят правильное формирование третичной структуры синтезируемых белков и задерживают их в клетке. В результате, даже если белки с измененной первичной структурой сохраняют биологическую активность, мутации тормозят их поступление в кровь и создают дефицит гормонов. Мутации в POMC уменьшают поступление медиаторов лептина — МСГ — в синаптическую щель, препятствуют проведению сигнала меланокортинов в нейронах гипоталамуса и индуцируют ожирение. Важную роль в этом процессе играют дисульфидные S—S связи в кодируемых белках. Вместе с водородными, гидрофобными и электростатическими взаимодействиями они участвуют в фолдинге практически всех белков в эндоплазматическом ретикулуме и закреплении пространственной структуры молекул, а торможение этого процесса индуцирует у человека не только ожирение, но и другие нарушения физиологических функций, включая воспаление [44], СД2 [45] и разные эндокринные заболевания.

Поскольку МСГ действуют через связывание с рецептором МК4Р, мутации в гене MC4R также вызывают нарушения липидного обмена. Первые мутации в MC4R в гетерозиготном состоянии c доминантным типом наследования были выявлены в 1998 г. в форме делеции 4 нуклеотидов СТСТ у отца и дочери [46] и вставки TTGA у женщины с ожирением [47]. Позднее в семьях с частым морбидным ожирением идентифицировано 7 мутаций в MC4R в гомозиготном состоянии. Среди них делеция двух нуклеотидов 750delGA, вызывающая сдвиг рамки считывания [48], полная делеция гена MC4R, нонсенс мутация Y287X и серия миссенс-мутаций [49]. Эффективные мутации в гомозиготном состоянии блокируют экспрессию MC4R, ликвидируют рецептор меланокортинов в гипоталамусе и вызывают тяжелое ожирение.

Более легкие нарушения развиваются у носителей мутаций в MC4R в гетерозиготном состоянии. Они равномерно распределяются в нуклеотидной последовательности MC4R и охватывают практически всю первичную структуру кодируемого белка [49, 50]. Нонсенс-мутации и сдвиги рамки считывания, как известно, блокируют экспрессию гена и ликвидируют рецептор. Более разнообразные эффекты проявляют миссенс-мутации. Они могут не оказывать заметного влияния на экспрессию гена, но тормозят эффективный процессинг синтезируемого белка и его встраивание в липидную мембрану, что создает дефицит рецептора МК4Р и снижает проведение гормональных сигналов меланокортинов [51], синтез которых в гипоталамусе активируется лептином.

Среди большого количества мутаций в гене MC4R [49, 50] у взрослых пациентов с ожирением идентифицирована замена S127L в гетерозиготном состоянии в третьем трансмембранном домене рецептора, замещающая короткий гидрофильный остаток Ser на протяженный гидрофобный Leu [51]. Появление гидрофобного Leu должно способствовать встраиванию рецептора в липидную мембрану и не препятствовать выполнению его биологической функции, поскольку мутация S127L не затрагивает внеклеточный домен, связывающийся с меланокортинами, и внутриклеточный домен, взаимодействующий с G-белками и проводящий гормональный сигнал внутрь клетки. Однако мутация S127L в МК4Р ассоциирована у людей с ожирением. Она впервые была представлена в нашем сообщении на 10-м конгрессе Европейской ассоциации нейроэндокринологов в Мюнхене в 2002 г. Несколько лет спустя появляются описания той же мутации у пациентов с ожирением из других регионов мира [37]. Это показывает, что мутации в MC4R довольно распространены в популяции. Замена S127C не нарушает ни экспрессию гена MC4R, ни фолдинг и встраивание кодируемого белка в липидную мембрану, но значительно снижает способность рецептора увеличивать продукцию цАМФ после связывания с α-МСГ [51]. По оценкам некоторых исследователей [49, 51], мутации в MC4R как причина ожирения выявляются у 6% обследованных пациентов с тяжелыми нарушениями липидного обмена.

Среди характеристик ожирения, вызываемого дефицитом МК4Р, следует отметить доминантный тип наследования, отсутствие задержки рост?