Гипофосфатемический рахит (ГФР), или витамин-D-резистентный рахит (ВДРР) — группа заболеваний, характеризующаяся развитием рахитических изменений костной ткани вследствие повышенного выведения фосфора из организма [1—3]. Основными клиническими признаками ГФР являются задержка роста, прогрессирующие деформации ног с момента начала ходьбы, мышечная слабость, боль в костях, позднее прорезывание зубов или их частый кариес и абсцессы. В зрелом возрасте развиваются нефрокальциноз, кальцификация связок, артрозы крупных суставов, остеопороз. При некоторых формах ГФР имеется нейросенсорная тугоухость. Из-за гетерогенности клинической картины диагностика гфр часто запаздывает, что ведет к неправильной тактике лечения. В РФ до настоящего времени отсутствуют данные о распространенности ГФР, а также алгоритмы диагностики и лечения этой патологии. Не проводились и исследования молекулярно-генетических основ данной группы заболеваний.

Цель исследования — определить клинические, гормонально-биохимические и молекулярно-генетические характеристики ГФР.

Диагноз ГФР основывался на наличии клинических (рахитические деформации скелета, деформации ног с момента начала ходьбы, задержка физического развития, спонтанные абсцессы зубов) и рентгенологических признаков рахита (деформации трубчатых костей, разряжение зон метафизов), а также лабораторных показателей (гипофосфатемия, гиперфосфатурия, гиперкальциурия). Расчет тубулярной реабсорбции фосфатов (TRP, %) производили по формуле:

где Pph — уровень фосфатов в плазме (ммоль/л), PCr — уровень креатинина в плазме (ммоль/л), Uph — уровень фосфатов в моче (ммоль/л), UCr — уровень креатинина в моче (ммоль/л). За норму принимали значения trp в интервале 85—95%. Данный показатель можно измерять в любое время суток [4].

Формулы для вычисления максимальной реабсорбции фосфатов с поправкой на СКФ (TmP/GFR, ммоль/л) зависели от значения trp. При TRP ≤86%

TmP/GFR=TRP路Pph,

а при TRP ≥86%

TmP/GFR=0,3·TRP/(1–0,8·TRP)·Pph.

Полученные значения сравнивали с референсными показателями для пациентов соответствующего пола и возраста (Payne, 1998).

Для вычисления индексов реабсорбции фосфатов необходимо одновременно производить забор крови из вены для определения уровней фосфора и креатинина) и определять эти показатели определять во вторичной разовой порции мочи. Гиперкальциурию диагностировали при соотношении Ca/креатинин в разовой порции мочи >0,8.

Геномную днк пациентов выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. Молекулярно-генетический анализ проводили методом высокопроизводительного параллельного секвенирования с использованием панели Custom Ion Ampliseq («Life Technologies», США), включавшей праймеры для мультиплексной амплификации 22 генов, ассоциированных с наследственными нарушениями фосфорно-кальциевого обмена. Найденные миссенс-мутации аннотировались с помощью программы ANNOVAR, которая позволяет сравнивать список однонуклеотидных замен, полученных по результатам секвенирования, с рядом специализированных баз данных [5].

Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом Эндокринологического научного центра Минздрава России (протокол № 12 от 22.10.14). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов или их родителей/официальных опекунов в соответствии с протоколом исследования.

Клинические и гормонально-биохимические характеристики.

Обследовали 75 пациентов (38 женщин и 37 мужчин в возрасте от 3 мес до 57 лет) с клиническими и биохимическими признаками гфр; семейная форма патологии была диагностирована у 36 пациентов, спорадическая — у 39. ГФР чаще всего манифестировал деформациями нижних конечностей с момента начала ходьбы (94,5%), гипотонией на первом году жизни (70,2%), множественным кариесом зубов (58%). Пациенты старшей возрастной группы предъявляли жалобы на быструю утомляемость при ходьбе, тугоподвижность суставов, спонтанные абсцессы зубов. У 47 пациентов имелось отставание в физическом развитии: медиана (Ме) роста составила –2,48 SD [–3,55; –1,53]. Самые низкие показатели роста отмечены в группе пациентов старше 18 лет (n=30), которые перенесли многократные операции по коррекции деформаций ног (ME роста –3,3 [–4,3; –2,21]). Данные лабораторных исследований: уровень неорганического фосфора в крови — Me = 0,79 ммоль/л [0,68; 0,92]; уровень паратгормона — Me = 59 пг/мл [37,9; 75]; Mе TRP =72,5% [65,8; 80]; Me TMP/GFR = 0,58 ммоль/л [0,46; 0,7]. У 65 пациентов показатели экскреции кальция соответствовали норме, у 4 пациентов выявлена гиперкальциурия.

Молекулярно-генетические характеристики

Генетическая причина заболевания была определена у 68 (90,5%) пациентов. Все обнаруженные мутации локализовались в гене PHEX, из них ранее были описаны 18, ранее не описанных оказалось 40 [21]. При семейных формах патологии мутации были обнаружены в 100% случаев, при спорадических — в 82%. Дефекты гена PHEX включали инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания (n=16), нонсенс-мутации (n=12), миссенс-мутации (n=14), делеции без сдвига рамки считывания (n=6), нарушение сплайсинга (n=9). У 1 пациента дефект гена PHEX (c.520_521insTTCAAGCACGG p. i174fs) сочетался с гетерозиготной мутацией в гене DMP1 (с. 475 C>A p. Q159K). У 7 пациентов ни в одном из генов-кандидатов мутаций не выявлено. Характерно, что у всех них заболевание было спорадическим.

Нами впервые в России исследованы 10 генов-кандидатов (PHEX, FGF23, DMP1, ENNP1, SLC34A1, SLC34A3, SLC9A3R1, SLC2A2, KL) у пациентов с гфр, а также проанализированы корреляции «генотип — фенотип». Дефект гена PHEX выявлен у всех пациентов с семейной формой и у 39 (82%) пробандов со спорадической формой заболевания. По типу наследования различают несколько форм ГФР; наиболее распространена Х-сцепленная доминантная форма (X-linked hypophosphatemia, XLH; MIM 307 800), частота которой составляет 1:20 000 родившихся. Данная форма ГФР обусловлена дефектами в гене PHEX (MIM 300550) [6, 7]. Менее распространены аутосомно-доминантная (ген FGF23, MIM 605380) [8], аутосомно-рецессивные (гены DMP1, MIM 600980; ENPP1, MIM 173335 и SLC34A3, MIM 609826) [9—12] и X-сцепленная рецессивная (ген CLCN5, MIM 300008) формы [13].

Биохимическими и гормональными маркерами гфр служат гипофосфатемия на фоне гиперфосфатурии, повышение активности щелочной фосфатазы, нормальный или умеренно повышенный уровень паратгормона при нормокальциемии. Концентрация 1,25 (OH)2D в сыворотке и степень кальциурии зависят от молекулярной основы заболевания [14].

По данным зарубежных исследований [15—20], в больших когортах пациентов с гфр поломки гена PHEX определяются в 50—80% случаев. С. Gaucher и соавт. [21] обнаружили дефекты гена PHEX в 79%, Y. Kinoshita и соавт. [22] — в 96% случаев. В нашем исследовании соответствующая величина составила 90,5%. Все это подтверждает роль инактивирующих мутаций гена PHEX как основной причины ГФР.

Ген PHEX (Phosphate regulating gene with Homology to Endopeptidases located on the X chromosome), включающий 22 экзона, кодирует протеин из 749 ааминокислот, который по своей структуре и функциям на 60—70% сходен с ферментами семейства M13 металлопептидаз. К ним относятся нейтральная эндопептидаза (NEP), эндотелин-превращающие факторы 1 и 2 (ECE-1 и 2) и Kell-антиген. Эти белки являются мембранными гликопротеинами, участвующими в расщеплении пептидных гормонов. В структуре пептидаз выделяют короткий N-концевой фрагмент, гидрофобный трансмембранный домен и большой C-внеклеточный домен с двумя Zn-связывающими мотивами и консервативными цистеиновыми остатками. Последний участок белка играет роль каталитического центра [3, 23]. Полагали, что продукт гена PHEX принимает участие в деградации фосфотонина FGF23. При инактивации этого гена концентрация FGF23 в крови в большинстве случаев возрастает, что снижает экспрессию генов SLC34A1 и SLC34A3, кодирующих натрий-фосфорные котранспортеры 2-го типа (соответственно NaPi-IIa и NaII-IIc). Эти котранспортеры регулируют реабсорбцию фосфора в проксимальных почечных канальцах; снижение их числа и активности ведет к потере организмом этого элемента. FGF23 также подавляет активность 1α-гидроксилазы (CEP27B1), которая образует активную форму витамина D (кальцитриол) и, наоборот, активирует 24-гидроксилазу (CYP24A1), превращающую кальцитриол в неактивные метаболиты [24].

Внутриклеточный фосфат принимает участие в аккумуляции энергии в виде АТФ, является неотъемлемой частью молекул днк и рнк, а также субстратом киназ и фосфатаз в клетке; внеклеточный фосфат необходим для построения кристаллов гидроксиапатита костного матрикса. Резкое снижение концентрации фосфора в крови может приводить к острой миопатии, сердечной дисфункции, нарушению целостности мембран нейтрофилов, тромбоцитов и эритроцитов. Следствием хронической недостаточности фосфора является нарушение минерализации костей и развитие рахита.

Однако, гены PHEX и FGF23 экспрессируются в остеобластах и остеоцитах, исследования на HYP-мышах (модель ГФР) не подтверждают прямого взаимодействия продуктов данных генов. Предполагается существование в данной системе пока неизвестного промежуточного фактора (рис. 1) [25—27].

Выявленные в нашем исследовании мутации локализовались по всей длине гена phex, с наибольшей плотностью в 3’-концевых участках и наиболее часто в экзонах 3, 5, 15, 17, 18, 22 (рис. 2).

Среди выявленных мутаций 17% встречались более чем один раз: I174fs (n=2), P549X (n=2), G579R (n=4), Q133X (n=2), Q197Q (n=2) и R747X (n=2). Выявленные нами дефекты часто наблюдались и в других исследованиях [6, 17, 21], что может указывать на наличие регионов в гене, особенно подверженных перестройкам [28]. Замена аргинина на глицин в кодоне 579 (p.g579r) экзона 17 была обнаружена у трех несвязанных между собой пациентов и двух двоюродных братьев; аналогичный дефект был описан ранее у пациентов немецкого, польского, испанского и корейского происхождения. Эта мутация представляет большой интерес, так как находится рядом с высококонсервативным Zn-связывающим участком фермента. Y. Sabbagh и соавт. [23] показали, что при таком дефекте белок менее устойчив к гликозилированию, быстрее подвергается внутриклеточной деградации и тем самым теряет способность встраиваться в плазматическую мембрану.

Белок PHEX содержит 10 высококонсервативных остатков цистеина, которые необходимы для формирования его структуры и каталитической активности. Нами было выявлено 14 различных миссенс-мутаций, одна из которых обусловливала замену цистеина на тирозин в положении 733 (C733Y). Ранее в этом же кодоне была описана замена цистеина на серин (C733S) [16]. Потеря остатка цистеина приводит к нарушению правильной упаковки белка из-за потерь дисульфидных связей. Замена тимина на гуанин (с.2192T>G p. F731C) в этом же экзоне гена PHEX, напротив, способствовала образованию нового цистеинового остатка c заменой консервативного фенилаланина. Другой функционально значимой перестройкой является замена пролина на серин в положении 534, которая может снижать гидрофобность белка и тем самым нарушать идентификацию лигандом области связывания [29].

Нонсенс-мутации в данном исследовании составили 21%, 5 из них (W88X, L45X, E304X, Y317X, S607X) считаются новыми, 7 были описаны ранее. Формирование стоп-кодона приводит к синтезу нефункционального белка.

Большие делеции составляют до 10% всех мутаций гена PHEX. T. Pekkarinen и соавт. [30] обнаружили делеции экзонов 8—11, а Y. Kinoshita и соавт. [22]— экзонов 12—22. В нашем исследовании делеции экзонов составили 10,7%. У одного мальчика ген PHEX полностью отсутствовал. У двоих выявлены делеции экзонов 18, 21 и 22. В данных экзонах расположены высококонсервативные остатки цистеина, поэтому можно предположить, что их потеря приводит к нарушению формирования вторичной структуры белка.

В литературе имеется описание пациентов с сочетанием дефектов гена PHEX с мутациями в генах DMP1, FGF23 [19]. Среди пациентов нашей когорты только у одного выявлена гемизиготная мутация в гене PHEX (p.I174fs) и гетерозиготная мутация в гене DMP1 (р.Q159K), которая была ранее описана [19]. Моноаллельная замена р. Q159K в гене DMP1 по предикторам базы данных ANNOVAR аннотирована как «условно патогенная» и, вероятнее всего, не влияет на развитие заболевания. В единичных случаях обнаруживаются гомозиготные мутации гена DMP1 у пациентов с аутосомно-рецессивной формой ГФР; большинство таких мутаций также локализуется в экзоне 6 [9, 31].

Проведение молекулярно-генетической диагностики в раннем возрасте позволяет своевременно начать консервативное лечение, которое может улучшить структуру костной ткани и конечный рост, а также уменьшить необходимость коррегирующих операций [7, 14, 32]. В настоящее время общепринятой схемой лечения является использование препаратов фосфора и активной формы витамина D. Однако результаты данной терапии неудовлетворительны. В последние годы показана высокая эффективность терапии с применением моноклональных антител к FGF23, которые нормализуют уровень фосфора в крови и уменьшают тяжесть клинических проявлений заболевания у взрослых пациентов [33].

Вопросы, касающиеся выбора лечебной тактики и возраста проведения оперативной коррекции деформаций нижних конечностей, остаются открытыми [34].

Проведенное исследование позволило установить причину заболевания практически у всей когорты пациентов. Метод высокопроизводительного параллельного секвенирования дает возможность одновременно выявлять поломки во всех генах-кандидатах, участвующих в регуляции фосфорно-кальциевого обмена. Полученные результаты подтвердили преобладание дефектов гена PHEX среди причин ГФР. Сложность строения, а также большой размер этого гена экономически оправдывают использование данного метода для молекулярно-генетической диагностики. Определение этиологического фактора имеет большое значение для пренатальной диагностики семейных форм заболевания, а также позволяет своевременно назначать консервативное лечение.

Дополнительная информация

Финансирование исследования

Исследование проведено при финансовой поддержке благотворительного фонда «Линия жизни», благотворительного проекта «Альфа-Эндо».

Конфликт интересов

Конфликт интересов авторов данного исследования отсутствует.

Благодарности

Данное исследование стало возможным при поддержке руководителя благотворительного фонда «Линия жизни» Фаины Захаровой, руководителя благотворительного проекта «Альфа-Эндо» Анны Карпушкиной.