Механизмы ранозаживления у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом

Авторы:
  • Е. В. Иванов
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • С. А. Гаврилова
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • М. П. Морозова
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • Е. М. Клочихина
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • А. К. Ердяков
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • А. М. Горбачева
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
  • З. Н. Джемилова
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия
  • Е. В. Артемова
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия
  • Г. Р. Галстян
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России, Москва, Россия
  • В. Б. Кошелев
    ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия
Журнал: Проблемы эндокринологии. 2018;64(5): 292-298
Просмотрено: 56 Скачано: 5

На сегодняшний день более 460 млн людей во всем мире страдают сахарным диабетом; по прогнозам Международной федерации диабета к 2040-му году число больных возрастет до 642 млн [1].

Сахарный диабет сопровождается развитием осложнений, в том числе синдромом диабетической стопы (СДС), одним из ведущих клинических симптомов которого является персистенция язвенного дефекта на коже нижних конечностей [2]. Развиваясь на фоне нейропатии, ишемии и постоянного травмирования, дополненных метаболическими сдвигами, индуцированными гипергликемией, такие язвенные дефекты плохо поддаются лечению, повышают риск ампутаций, инвалидизации и смерти пациентов [3]. Описанная ситуация обусловливает актуальность изучения патогенетических аспектов формирования хронических ран при сахарном диабете и потенциальных способов их лечения.

В настоящее время уделяется особое внимание влиянию нервной системы на ключевые механизмы ранозаживления, особенно на пролиферацию и миграцию кератиноцитов — основных клеток кожного покрова человека [4].

Сложность изучения механизмов ранозаживления при сахарном диабете связана, во-первых, с наличием в коже собственной не-нейрональной катехоламинергической системы [5] и, во-вторых, с тем, что реакция кератиноцитов зависит от внутриклеточной системы посредников [6—9]. В экспериментах на клеточных культурах доказана роль β2-адренорецепторов (β2АР) в регуляции жизненного цикла кератиноцитов. Эти рецепторы представляют собой трансмембранные белки, связанные с G-белками, которые в большом количестве экспрессируются недифференцированными кератиноцитами кожи человека. От того, какая α-субъединица G-белка экспрессируется клеткой (Gαs или Gαi), зависит повышение или снижение внутриклеточного уровня цАМФ. Стимуляция β2АР способствует усилению гальванотаксиса, миграции, пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Наличие и влияние других подтипов адренорецепторов менее изучены. Данные, полученные на клетках, не учитывают регуляторных влияний организма, изменений скорости метаболизма медиаторов, плотности нервных окончаний, выраженности нейропатии при сахарном диабете.

Показано, что у кератиноцитов, выращенных в условиях повышенного содержания глюкозы в среде, нарушены пролиферация и миграция (снижена экспрессия интегрина α3, фактора роста кератиноцитов). Такие клетки формируют неполноценные щелевые контакты, в них усиливается окислительный стресс, повышается уровень апоптоза. В окружающих кератиноциты тканях при сахарном диабете нарушен ангиогенез, избыточно продуцируются матриксные металлопротеиназы, высоки риски инфицирования [10—12]. Все это способствует формированию хронической незаживающей раны. Однако комплексных исследований, посвященных влиянию нейропатии на ранозаживление при сахарном диабете, нами не обнаружено.

Цель исследования — изучение развития нейропатии как возможного механизма нарушения ранозаживления в стрептозотоциновой модели сахарного диабета у крыс.

Материал и методы

Исследование выполняли на 70 самцах белых беспородных крыс массой 350±25 г. Животных содержали в условиях вивария с регулируемым световым режимом (12 ч день, 12 ч ночь) со свободным доступом к воде и пище. Крыс рандомизировали в группы по массе тела и вариабельности ритма сердца.

Сахарный диабет моделировали однократной внутрибрюшинной (в/б) инъекцией стрептозотоцина в дозе 65 мг/кг в холодном 0,1 М цитратном буфере (pH=4,5, t=+4 °С) [3]. На 3-и сутки оценивали уровень глюкозы в крови. Животные с уровнем глюкозы ниже 15 мМ/мл из эксперимента исключались. День верификации сахарного диабета считали первым днем его развития (группа СД). Далее, в течение всего эксперимента, 1 раз в день в первой половине дня животные этой группы получали поддерживающую инъекцию инсулина детемира (препарат Левемир) в дозе 2 Ед/кг в физиологическом растворе подкожно. Дозу инсулина подбирали предварительно таким образом, чтобы в течение 1 сут сохранялась значительная гипергликемия.

В качестве контроля исследовали крыс, получивших однократную в/б инъекцию холодного 0,1 М цитратного буфера (pH=4,5, t=+4 °С) в пропорциональном объеме (группа ЦБ, контроль). Инъекцию стрептозотоцина или цитратного буфера проводили во второй половине дня, в период наименьшей активности животных. Дополнительно исследовали интактных (группа ИК) животных.

Уровень глюкозы в крови крыс оценивали еженедельно (глюкометр iCheck).

Болевую чувствительность (период между моментом погружения кончика хвоста животного на 2 см в воду температурой 55 °C и временем отдергивания хвоста) измеряли еженедельно.

На 42-е сутки наркотизированным хлоралгидратом крысам групп СД и ЦБ ниже левой лопатки наносили круглую рану диаметром 2 см (иссечение ножницами). После нескольких операций из-за вызываемой хлоргидратом смерти животных его заменили на диэтиловый эфир. Оценку площади раневой поверхности проводили сразу после нанесения раны и далее каждые 3-и сутки в программе Universal Desktop Ruler. Забор проб кожи проводили на 8, 16 и 24-е сутки после моделирования раны. Забор ткани кожи у животных группы ИК проводили на 4-м месяце жизни. В каждый срок забор кожи осуществляли у 10 животных каждой группы.

Полученные фрагменты кожи фиксировали, дегидратировали и заливали парафином по стандартной методике. Образцы нарезали таким образом, чтобы в микропрепарат попадали участки раневого дефекта и окружающей его неповрежденной кожи. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Для иммуногистохимического окрашивания на Ki-67, α1-, β1— и β2-АР использовали первичные антитела кролика (Abcam), вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (козел против кролика, Abcam), и систему визуализации DAB. Препараты изучали с помощью светового микроскопа Zeiss Imager A1 Axio («Zeiss», Германия), фотографии получали с помощью программы AxioVision 3,5 («Zeiss», Германия). Относительную плотность окрашивания измеряли в программе ImagePro и сравнивали с отрицательным контролем (образцы, окрашенные без первичных антител).

Условия проведения

Эксперимент проводили на базе кафедры физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины (ФФМ) Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Этическая экспертиза

При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики». На проведение экспериментов было получено разрешение комиссии ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова по биоэтике.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили в пакетах программ Statistica 10.0 и IBM SPSS Statistics 23.0. Для оценки выживаемости применяли модель Кокса, допускающую частичную неполноту данных [2]. Для оценки динамики ранозаживления и изменения болевой чувствительности использовали функцию дисперсионного анализа повторных измерений (repeated measures ANOVA) [2]. Для сравнения плотностей экспрессии различных белков использовали многофакторный дисперсионный анализ с построением смешанной линейной модели (метод наименьшей значимой разницы по Фишеру). Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты

Общее состояние животных

Однократная инъекция стрептозотоцина приводила к развитию сахарного диабета у крыс на 3-и сутки: уровень глюкозы в крови в 4—7 раз превышал исходный (6,2 мМ) и оставался повышенным на протяжении всего эксперимента. Для увеличения выживаемости животным с диабетом ежедневно вводили инсулин. За весь срок эксперимента погибли 3 крысы из 70. Исходная масса крыс составляла в группе СД 367±55 г, в группе ЦБ 372±73 г, в группе ИК 360±84 г. Потеря массы тела у животных группы СД, несмотря на поддерживающую инсулинотерапию, постепенно увеличивалась и к концу эксперимента составила 25%. Животные группы ЦБ, напротив, к концу опыта прибавили в массе в среднем 20% (р<0,01).

Динамика болевой чувствительности

Для оценки развития нейропатии проводили тест с отдергиванием хвоста. У животных групп ЦБ и ИК время отдергивания хвоста, опущенного в воду температуры 55 °C, было практически одинаковым и составляло в среднем 1,7±0,3 с. После моделирования СД, начиная с 7-х суток, это время постепенно нарастало и к 56-м суткам составило 2,9±0,4 с (р=0,017).

Динамика ранозаживления

cкорость ранозаживления у крыс групп СД и ЦБ практически не различалась =0,672). Однако это могло быть связано с большим разбросом размеров раны в группе СД (рис. 1).

Рис. 1. Динамика ранозаживления у крыс разных групп (М±m).
В группе ЦБ в отличие от СД у всех крыс рана зажила к 24-м суткам.

Морфологический и иммуногистохимический анализы заживления раны

У интактных крыс в срезах кожи, окрашенных гематоксилином и эозином, визуализирован нормальной толщины эпидермис с четко выраженными базальным, шиповатым и зернистым слоями (рис. 2, а).

Рис. 2. Морфология кожи крыс при окраске гематоксилином и эозином. 1 — грануляционная ткань, 2 — некротические массы, 3 — край раны, 4 — фиброзная ткань.

На 8-е сутки после нанесения раны большая часть раневой поверхности была закрыта грануляционной тканью, интенсивно инфильтрированной клетками воспаления: нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами (см. рис. 2, б). Грануляционную ткань покрывал слой некротических масс. Регенерирующий край эпидермиса часто был утолщен.

На 16-е сутки наблюдались затухание воспалительного процесса и исчезновение признаков острого повреждения. Большая часть ран была покрыта грануляционной тканью, эпидермис у края раны был значительно утолщен (см. рис. 2, в). Под формирующимся эпидермисом образовались фиброзная ткань, рубец. У некоторых крыс группы ЦБ, но не СД, реэпителизация раны завершилась к 16-м суткам.

На 24-е сутки после моделирования раны формировался грубоволокнистый рубец, покрытый тонким слоем эпидермиса (см. рис. 2, г). У ряда крыс группы СД и в этот срок полной регенерации кожи не происходило.

Иммуногистохимическое окрашивание

Общий вид препаратов, окрашенных методом иммуногистохимии, представлен на рис. 3.

Рис. 3. Примеры иммуногистохимического окрашивания. ДАБ: а — отрицательный контроль — неспецифически окрашивается только полоска рогового слоя эпидермиса, б — окрашивание на β2-адренорецепторы, край раны, окрашенные клетки расположены преимущественно в глубоких слоях, в — окрашивание на Ki-67, край раны.

Кератиноциты кожи крыс группы ИК в значительной степени экспрессировали Ki-67, маркер клеточной пролиферации, что соответствует высокой регенеративной активности эпидермиса. Нанесение раны крысам группы ЦБ на ранних сроках незначимо влияло на регенеративную активность. На 24-е сутки заживления, когда у всех крыс в этой группе уже завершилась реэпителизация, экспрессия маркераKi-67 как в крае раны, так и в относительно отдаленных участках кожи значимо уменьшилась по сравнению с предыдущими временными точками у интактных животных и крыс группы СД (рис. 4).

Рис. 4. Плотность окрашивания на маркер Ki-67 (М±m): а — в отдаленных участках кожи, б — в крае раны. * — p<0,05 по сравнению с группой ЦБ, ** — p<0,05 по сравнению с группой ИК, *** — p<0,05 по сравнению с 8-ми сутками внутри группы, & — p<0,05 по сравнению с 16-ми сутками внутри группы.

В группе СД как на 8-е, так и на 16-е сутки в обеих локализациях экспрессия Ki-67 значимо не изменилась, но на 24-е сутки в области края раны увеличилась по сравнению с группой ИК (р=0,036), ЦБ (р=0,041) и предыдущей временно́й точкой (р=0,028).

В большинстве временных точек как в группе СД, так и в группе ЦБ экспрессия Ki-67 значимо не различалась в крае раны и на некотором отдалении от него. Лишь на 24-е сутки в группе СД в крае раны окрашивание на Ki-67 оказалось интенсивнее, чем в отдаленном участке эпидермиса (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение плотности окрашивания на Ki-67 в крае раны и отдаленном участке эпидермиса на 8, 16 и 24-е сутки в группе СД (М±m); * — p<0,05 по сравнению с краем раны.

Таким образом, в группе СД экспрессия маркера пролиферации увеличилась в крае раны на 24-е сутки после ее нанесения (р=0,04), что свидетельствует об усилении регенеративных процессов, в то время как в группе ЦБ экспрессия маркера на 24-е сутки значимо уменьшилась на фоне завершившейся к этому моменту реэпителизации раны (р=0,031).

Ни в одной группе, включая ИК, мы не обнаружили окрашивания эпидермиса на β1— и α1-АР, что может свидетельствовать об отсутствии их экспрессии кератиноцитами крыс. С другой стороны, β2-адренорецепторы в значительной степени экспрессировались кератиноцитами животных всех групп, включая И.К. Следует отметить преимущественно базальное расположение положительно окрашенных клеток в эпидермисе (см. рис. 2, б).

На 8-е и 16-е сутки экспрессия β2-АР не различалась между группами и участками кожи. На 24-е сутки их экспрессия уменьшилась в группе ЦБ в отдаленных участках кожи (р=0,046) (рис. 6).

Рис. 6. Интенсивность экспрессии β2-АР в разных участках кожи крыс с СД на разных сроках ранозаживления. а— отдаленный от раны участок кожи; б — край раны. * — p<0,05 по сравнению с группой ИК, согласно многофакторному дисперсионному анализу.

Обсуждение

Нейропатия является одним из возможных механизмов нарушения ранозаживления в стрептозотоциновой модели сахарного диабета у крыс.

Результаты теста болевой чувствительности показали, что у крыс группы СД на исследуемых сроках ранозаживления развивается периферическая нейропатия, затрагивающая чувствительные нервные окончания [11, 12]. Морфологические изменения кожи животных и иммуногистохимические данные согласуются с развитием нейропатии, что позволяет говорить о взаимосвязи этих изменений.

Хотя скорость заживления раны, нанесенной на 42-е сутки развития гипергликемии, статистически не различалась у животных контрольной (ЦБ) и диабетической (СД) групп, но у всех крыс группы ЦБ с течением времени рана уменьшилась, снижался внутригрупповой разброс, и к 24-м суткам после нанесения раны у всех крыс этой группы имело место полное заживление. В группе СД были выявлены животные с более высокой и более низкой скоростью ранозаживления, но ни у одной крысы этой группы к 24-м суткам рана не закрылась полностью. Это повысило внутригрупповой разброс, что и препятствовало выявлению различий между группами ЦБ и С.Д. Разная скорость ранозаживления у крыс с СД может быть вызвана разным уровнем гипергликемии, которая зависит от чувствительности β-клеток поджелудочной железы к стрептозотоцину.

При исследовании гистологических образцов на светооптическом уровне картина острой раны у крыс постепенно сменялась картиной ранозаживления вторичным натяжением: уменьшалась лейкоцитарная инфильтрация, формировался конус ранозаживления, прорастали новые сосуды, раневой дефект заполнялся соединительной тканью. В группе ЦБ на 24-е сутки после нанесения раны (56-е сутки эксперимента) репарация раны завершилась, в группе СД наблюдалось замедление развития всех этапов заживления; к концу эксперимента у большей части животных этой группы рана не закрылась.

Окрашивание на Ki-67 выявило высокий уровень пролиферативной активности в коже интактных крыс. Формирование раны не изменило уровень пролиферации в группе ЦБ ни в отдаленном от края раны участке кожи, ни в крае раны. На месте раны снизился общий уровень пролиферации при полном ее заживлении. Интересно, что у животных группы СД к 24-м суткам после моделирования раны в краю раны на фоне незажившего дефекта экспрессия Ki-67 возросла. Результат свидетельствует о том, что репарация кожи у здоровых крыс происходит за счет избирательного изменения пролиферативной активности различных подтипов кератиноцитов, когда рана закрывается, под тонким слоем эпидермиса продолжаются процессы восстановления здорового кожного покрова в нижних слоях кожи. На этом фоне снижается экспрессия Ki-67 кератиноцитов. У животных с СД, скорее всего, нарушается процесс активации популяции кератиноцитов, участвующих в ранозаживлении, поэтому базовой пролиферативной активности не хватает для успешного устранения дефекта кожи, и к 24-м суткам после нанесения раны наблюдается увеличение уровня Ki-67.

Мы не выявили какой-либо связи между сахарным диабетом, стадиями ранозаживления и плотностью адренорецепторов в эпидермисе кожи крыс. Плотность окрашивания β2-АР в кератиноцитах значимо не различалась между группами. Снижение экспрессии рецепторов в удаленной от раны коже крыс в группе ЦБ пока не имеет объяснения. В целом можно прийти к заключению, что плотность β2-АР у крыс с сахарным диабетом не меняется в процессе ранозаживления. Тем не менее для формирования определенных выводов о наличии или отсутствии изменений периферической иннервации в процессе ранозаживления у крыс с сахарным диабетом требуется более подробное изучение данного вопроса, включающее оценку состояния других компонентов симпатической и парасимпатической нервной системы в коже.

Заключение

Проведенное исследование позволило получить новую информацию о ранозаживлении в модели стрептозотоцинового диабета у крыс. На фоне поддерживающей инсулинотерапии в предложенном протоколе у крыс развивался сахарный диабет, не обусловливающий смерть животных в течение 56 сут. При этом постепенно снижалась болевая чувствительность, что особенно ярко проявилось к 56-м суткам эксперимента. Результаты морфологического исследования указывают на ухудшение реэпителизации раны у крыс группы СД. В крайней точке исследования у них увеличилась пролиферативная активность кератиноцитов края раны, тогда как в группе ЦБ к этому моменту закончилась эпителизация, и пролиферативная активность, напротив, снизилась. Плотность β2-АР у крыс не меняется ни при сахарном диабете, ни в процессе ранозаживления.

Изучение плотности иннервации в коже края ран, концентрации метаболитов нейромедиаторов, а также расширение спектра исследуемых нейрональных и не-нейрональных систем регуляции ранозаживления позволят сформировать комплексное представление о процессах, протекающих в хронической диабетической ране, найти новые потенциальные мишени для терапии и в конечном счете улучшить качество оказываемой помощи пациентам с СДС.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа поддержана Российским научным фондом (грант РНФ № 16−15−10365).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов:

Гистологическая обработка образцов ткани, иммуногистохимическое окрашивание, анализ полученных данных, их статистическая обработка, поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации — Иванов Е.В.; подготовка и ведение экспериментов на животных, поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации — Горбачева А.М.; поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации, редактирование текста публикации — Гаврилова С.А..

Подготовка и ведение экспериментов на животных, оценка иммуногистохимического окрашивания образцов на срезах — Морозова М.П.; подготовка и ведение экспериментов на животных — Клочихина Е.М.; поиск и анализ информации в международных базах данных, написание текста публикации, редактирование текста публикации — Ердяков А.К., Артемова Е.В.

Редактирование текста публикации — Галстян Г.Р., Кошелев В.Б.

Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Список литературы:

  1. Токмакова А.Ю., Страхова Г.Ю., Арбузова М.И. Особенности хронических ран у больных сахарным диабетом и пути их коррекции. // Эндокринная хирургия. — 2007. — Т. 1. — № 1. — C. 38—42. doi: https://doi.org/10.14341/2306-3513-2007-1-38-42
  2. Garwood CS, Steinberg JS, Kim PJ. Bioengineered alternative tissues in diabetic wound healing. Clin Podiatr Med Surg. 2015;32(1):121-133. doi: https://doi.org/10.1016/j.cpm.2014.09.004
  3. Demidova-Rice TN, Hamblin MR, Herman IM. Acute and impaired wound healing: pathophysiology and current methods for drug delivery, part 1: normal and chronic wounds: biology, causes, and approaches to care. Adv Skin Wound Care. 2012;25(7):304-314. doi: https://doi.org/10.1097/01.asw.0000416006.55218.d0
  4. Roosterman D, Goerge T, Schneider SW, et al. Neuronal control of skin function: the skin as a neuroimmunoendocrine organ. Physiol Rev. 2006;86(4):1309-1379. doi: https://doi.org/10.1152/physrev.00026.2005
  5. Grando SA, Pittelkow MR, Schallreuter KU. Adrenergic and cholinergic control in the biology of epidermis: physiological and clinical significance. J Invest Dermatol. 2006;126(9):1948-1965. doi: https://doi.org/10.1038/sj.jid.5700151
  6. Grando SA, Kist DA, Qi M, Dahl MV. Human Keratinocytes Synthesize, Secrete, And Degrade Acetylcholine. J Invest Dermatol. 1993;101(1):32-36. doi: http//doi.org/10.1111/1523-1747.ep12358588.7
  7. Inoue R, Yoshihisa Y, Tojo Y, et al. Localization of serine racemase and its role in the skin. J Invest Dermatol. 2014;134(6):1618-1626. doi: https://doi.org/10.1038/jid.2014.22
  8. Pullar CE, Manabat-Hidalgo CG, Bolaji RS, Isseroff RR. Beta-Adrenergic receptor modulation of wound repair. Pharmacol Res. 2008;58(2):158-164. doi: https://doi.org/10.1016/j.phrs.2008.07.012
  9. Ramaekers G, Lamers J, Verhey F, et al. A comparative study of the effects of carbamazepine and the NMDA receptor antagonist remacemide on road tracking and car-following performance in actual traffic. Psychopharmacology (Berl). 2002;159(2):203-210. doi: https://doi.org/10.1007/s002130100898
  10. Biessels GJ, Bril V, Calcutt NA, et al. Phenotyping animal models of diabetic neuropathy: a consensus statement of the diabetic neuropathy study group of the EASD (Neurodiab). J Peripher Nerv Syst. 2014;19(2):77-87. doi: https://doi.org/10.1111/jns5.12072
  11. Румянцев П.О., Саенко В.А., Румянцева У.В. и др. Статистические методы анализа в клинической практике. Часть 2. Анализ выживаемости и многомерная статистика. // Проблемы эндокринологии. — 2009. — № 55(6). — C. 48—56. doi: https://doi.org/10.14341/probl200955648-56
  12. Yorek MA. Alternatives to the streptozotocin-diabetic rodent. Int Rev Neurobiol. 2016;127:89-112. doi: https://doi.org/10.1016/bs.irn.2016.03.002