В настоящее время признано, что программа ЭКО и ПЭ является эффективным методом лечения бесплодия. Благодаря вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ) в мире родилось уже около 3 млн человек. В России в 2007 г. проведено более 20 тыс. лечебных циклов ВРТ, и с каждым годом это количество увеличивается. Поэтому повышение эффективности и безопасности методов ВРТ является актуальной задачей современной репродуктивной медицины [1].

Наиболее важная задача программы ЭКО и ПЭ — рождение здорового ребенка. Однако большое количество исследований свидетельствует о том, что частота хромосомных нарушений эмбрионов, полученных методом ЭКО/ИКСИ, чрезвычайно высока, и хорошая морфология эмбрионов не является доказательством отсутствия данной патологии. Многие исследователи полагают, что именно эмбрионы с хромосомной патологией обусловливают низкую эффективность в программах ЭКО/ИКСИ и частую потерю беременности при проведении вспомогательных репродуктивных программ. Необходимость исследований в этой области сделала актуальным развитие молекулярно-генетических методов доимплантационного генетического анализа эмбрионов с целью диагностики возможных генетических нарушений.

Идея проведения преимплантационного генетического исследования эмбрионов появилась еще до рождения первого «ребенка из пробирки». В 1967 г. вышла статья Р. Эдвардса и Р. Гарднера [2] о проведении биопсии эмбрионов кролика с целью определения пола до имплантации, где была показана возможность забора биологического материала у эмбрионов на ранних стадиях развития с сохранением их жизнеспособности. Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов человека стала возможной в начале 90-х годов XX века. В это время был достигнут достаточный технологический уровень экстракорпорального оплодотворения и разработан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для единичных клеток.

Доктор А. Хандисайд и соавт. [3] в 1989 г. успешно провели попытку определения пола при помощи ПЦР-анализа бластомера, взятого у эмбриона на 3-и сутки развития (6—8 бластомеров). Год спустя состоялись первые успешные роды после подобной процедуры у супружеской пары с риском наследования Х-сцепленного рецессивного заболевания.

В том же 1990 г. группа под руководством Ю. Верлинского [4] сообщила о диагностике моногенного заболевания, проведенной по 1-му полярному тельцу, полученному из яйцеклетки до оплодотворения. Для проведения данной диагностики была использована ПЦР.

Первый ребенок после преимплантационной ПЦР-диагностики моногенного заболевания (муковисцидоза) родился в 1992 г.

В настоящее время наиболее широко используемыми молекулярно-генетическими методами преимплантационного генетического скрининга являются методика флюоресцентной гибридизации in situ (FISH, fluorecence in situ hybridization) и количественная флюоресцентная ПЦР (КФ=ПЦР; quantitative fluorescence polymerase reaction, QF-PCR) [5].

Методика FISH — молекулярно-цитогенетический метод, разработанный в 80-х годах прошлого столетия для выявления определенных последовательностей ДНК на хромосоме.

Преимущества FISH-методики заключаются в относительной простоте выполнения, быстроте получения результатов и возможности диагностики наиболее распространенных видов анеуплоидий одновременно.

Флюоресцентная гибридизация in situ — комбинация методов цитогенетики и молекулярной генетики. Принцип метода FISH заключается в связывании ДНК-зонда, меченного флюоресцентным красителем, с ДНК хромосомы исследуемого образца. Зонд представляет собой небольшой фрагмент ДНК, который комплементарно связывается с определенным участком хромосомы. Далее образцы исследуются с помощью флюоресцентной микроскопии при использовании подходящих для зондов светофильтров. С помощью данного метода можно идентифицировать целые хромосомы, хромосомно-специфичные области или однокопийные уникальные последовательности, в зависимости от используемых методик маркировки.

Особенностью FISH-метода, принципиально отличающей его от классического цитогенетического анализа, является то, что данный метод применим как для метафазных, так и для интерфазных ядер. Это и позволило использовать данную методику в преимплантационном генетическом скрининге и диагностике.

Метод FISH можно применять на любом клиническом исследовательском микроскопе, обладающем функцией получения флюоресцентных изображений.

Несмотря на то что изображения могут быть получены и проанализированы в ручном режиме, для увеличения эффективности и точности часто применяется программное обеспечение для анализа изображений в сочетании с автоматизированной микроскопией.

Еще одна распространенная молекулярно-генетическая методика, используемая для преимплантационного генетического скрининга анеуплоидий, — КФ-ПЦР. Этот метод позволяет проводить быструю (1—2 дня) детекцию наиболее распространенных анеуплоидий (13, 18, 21-й и половых хромосом), составляющих более 80% всех клинически значимых хромосомных патологий, диагностируемых в пренатальном периоде [5].

В ходе данного метода на исследуемых хромосомах с использованием мультиплексной ПЦР амплифицируются высокополиморфные короткие тандемные повторы (short tandem repeats, STR) с участием праймеров, меченных флюоресцентными красителями. Полученные в процессе ПЦР фрагменты в дальнейшем анализируются с помощью капиллярного электрофореза в генетических анализаторах [6]. Показано, что воспроизводимые результаты могут быть получены даже при небольшом количестве исходного биоматериала. Для данного метода подходят такие виды биоматериала, как полярные тельца, единичные бластомеры, клетки трофоэктодермы, амниотическая жидкость, ворсины хориона, кровь плода, постнатальная кровь и образцы тканей плода. Для каждой хромосомы тестируются 3—4 коротких тандемных повтора для избежания получения неинформативных результатов. В случаях нормы необходимо выявить как минимум два информативных результата для одной хромосомы, проявляющихся в нормальном гетерозиготном паттерне (2 аллели) с двумя пиками в соотношении 1:1, моноаллельный паттерн с одним пиком не информативен. В случаях трисомии присутствие трех аллелей доказывается наличием трех пиков в соотношении 1:1:1 (трехаллельный трисомический паттерн), или двух аллелей в соотношении 2:1 или 1:2 (двухаллельный трисомический паттерн). Для расчета соотношений может использоваться как высота пика, так и площадь под кривой.

Использование КФ-ПЦР для детекции анеуплоидий было начато еще в начале 90-х годов XX века [7]. Точность метода по определению наиболее частых видов анеуплоидий сравнима с таковой у FISH [6].

Преимуществом же метода по сравнению с FISH является его относительная дешевизна и возможность одновременного анализа гораздо большего количества образцов. КФ-ПЦР позволяет детектировать уровень мозаицизма порядка 20—30% [8] и превосходит методы традиционного кариотипирования и FISH в плане возможности обнаружения контаминации образцов материнскими клетками [9].

Ограничением метода, безусловно, является то, что он способен лишь обнаруживать специфические хромосомные изменения, не позволяя проводить детекцию нарушений, лежащих вне пределов, ограниченных праймерами [5].

В настоящее время появились новые современные молекулярно-цитогенетические методики, которые успешно применяются в преимплантационной диагностике, позволяющие провести исследование 24 хромосом одновременно. К таким методам относятся различные варианты сравнительной геномной гибридизации.

Метод сравнительной геномной гибридизации (СГГ, comparative genome hybridization, CGH) был разработан в начале 90-х годов XX века Т. Кремером и в настоящее время с модификациями получил широкое распространение в науке и медицине. Суть метода заключается в гибридизации предварительно меченных двумя разными флюоресцентными красителями фрагментированных молекул ДНК из исследуемого и контрольного образцов с фиксированными на стеклянной подложке метафазными пластинками. Наличие делеции в исследуемом геноме приведет к тому, что аналогичные фрагменты ДНК контрольного образца будут присутствовать в избытке, это отразится на интенсивности соответствующего флюоресцентного сигнала при дальнейшей гибридизации на метафазных пластинках. Наличие же дупликации этого или другого региона приведет к противоположной картине — на соответствующем участке генома исследователь обнаружит увеличение флюоресцентного сигнала другого цвета [10].

В настоящее время широкое распространение получила модификация этого метода под названием «сравнительная геномная гибридизация на биологических чипах» (array CGH, aCGH, matrix CGH). В данной модификации исследуемая и референсная ДНК гибридизуется не на метафазных пластинках, а на ДНК-зондах, представляющих собой относительно короткие фрагменты генома изучаемого организма. Использование для метода СГГ биочипов привело к увеличению воспроизводимости метода, его точности и разрешающей способности [11].

Еще в конце 90-х годов прошлого века метод СГГ привлек к себе пристальное внимание специалистов в области репродуктивной медицины. Уже тогда было известно, что около половины всех случаев потерь беременности на ранних сроках связано с анеуплоидиями или другими грубыми хромосомными нарушениями [12]. Вместе с тем FISH — на то время практически главный метод преимплантационной генетической диагностики, не всегда позволял провести их выявление. Как правило, для FISH-диагностики используется ограниченное количество зондов, позволяющих осуществлять детекцию только самых распространенных хромосомных аномалий. Как правило, это анеуплоидии по хромосомам 13, 16, 18, 21, X и Y, редко анализируется более 12 хромосом. Также имеются известные ограничения на работу с одной клеткой, далеко не всегда позволяющие получить достоверные результаты в ходе исследования единичных бластомеров, полярных телец и трофоэктодермы [13].

Что же касается метода СГГ на биологических чипах, то его неоспоримым достоинством является возможность определения как микроскопических хромосомных нарушений (таких как анеуплоидии, в том числе и мозаицизм, несбалансированных транслокаций и маркерных хромосом), так и субмикроскопических (микроделеционные/микродупликационные синдромы, несбалансированные субтеломерные перестройки) сразу во всем геноме. К ограничениям данного метода относится невозможность выявления сбалансированных перестроек (реципрокные транслокации, инверсии, робертсоновские транслокации, реципрокные инсерции) и ряда несбалансированных перестроек (перестройки за границей разрешения, точечные мутации, тринуклеотидные экспансии, делеции и дупликации ниже границы чувствительности) [14].

Проведенные исследования показали, что чувствительность выявления анеуплоидий с помощью метода СГГ по сравнению с FISH выше на 20—25%. Учитывая, что кроме анеуплоидий с помощью СГГ выявляются и другие хромосомные нарушения, не обнаруживаемые при использовании FISH, ценность метода возрастает еще больше. Показано, что применение метода СГГ приводит к повышению результативности программы ЭКО, экономии времени и средств [15].

В данном обзоре была поставлена задача описать молекулярно-генетические методы, наиболее широко применяемые для преимплантационного генетического скрининга в программах ВРТ. Следует отметить, что в настоящее время сформирован ряд медицинских показаний для проведения преимплантационного генетического скрининга. Основные из них:

— возраст женщины;

— невынашивание беременности в анамнезе;

— регулярные ЭКО потери;

— неоднократные неудачные попытки ЭКО;

— тяжелая нефертильность мужчины;

— определение пола (условное показание).

Проведение преимплантационной генетической диагностики возможно по полярным тельцам, полученным из яйцеклетки, по единичным бластомерам, полученным от эмбрионов на стадии развития 6—8 бластомеров, а также по биопсийному материалу трофоэктодермы.

Основными проблемами преимплантационного генетического скрининга остаются малое количество ДНК в биологическом материале, которое возможно получить из раннего эмбриона, а также контаминация чужеродной ДНК при заборе материала. Следует учитывать, что приблизительно 10% анализируемых клеток не дают результатов.

Наиболее перспективным представляется скорейшее внедрение в повсеместную практику метода ССГ на биочипах. В настоящее время препятствием для широкого использования данного метода диагностики является его высокая стоимость. Однако, учитывая скорость развития молекулярно-биологических методов диагностики, можно надеяться на скорейшее внедрение в практику ВРТ описанной методики, которая позволит проводить исследование преимплантационных эмбрионов с наибольшей диагностической значимостью получаемых результатов.