Актуальность настоящего исследования обусловлена наблюдающейся в последние десятилетия во многих странах выраженной тенденции к снижению у мужчин активности сперматогенеза [1]. Многочисленными клиническими наблюдениями и экспериментальными исследованиями [2] установлено, что на процесс сперматогенеза оказывают повреждающее воздействие многочисленные факторы, в том числе физические, химические, бытовые. Вместе с тем на сегодняшний день явно недостаточно изучено влияние нарушений условий внутриутробного развития на антенатальное формирование, пролиферацию и дифференцировку сперматогенного эпителия, являющегося источником образования полноценных половых клеток у взрослого человека.

Общеизвестно, что одной из важнейших причин перинатальной патологии являются экстрагенитальные заболевания женщин детородного возраста [3]; в структуре этих заболеваний особое место занимают болезни гепатобилиарной системы, в том числе возникающие при хронической алкогольной интоксикации [4].

Цель настоящего исследования - анализ морфофункциональных характеристик сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени алкогольного генеза.

Работа выполнена на белых лабораторных крысах Вистар (19 взрослых половозрелых самок) и их половозрелом 70-дневном потомстве (18 крысят).

Для достижения поставленной цели у взрослых половозрелых крыс-самок хроническую алкогольную интоксикацию путем замены питьевой воды 15% раствором этилового спирта в течение 3 мес [5]. После чего у них выявлялось поражение печени, о наличии которого судили на основании морфологических (жировая дистрофия гепатоцитов, расширение синусоидных капилляров и перисинусоидного пространства, дискомплексация печеночных балок, умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация стромы печени, некротические изменения гепатоцитов, носящие очаговый характер), биохимических (повышение активности γ-глутаминилтранспеп­тидазы, аспартатаминотрансферазы, повышение концентрации билирубина) и иммунологических (высокий титр противопеченочных антител) критериев. Через 3 мес после начала эксперимента животные получали свободный доступ к питьевой воде. Еще через 1 нед самок подсаживали к интактным половозрелым самцам. Потомство от этих самок составило «алкогольную» группу (10 крысят из 9 пометов).

Контрольную группу составило потомство от интактных родителей: 8 крысят на 70-й день постнатального развития из 8 пометов.

Работа с лабораторными животными выполнялась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12.08.77 МЗ СССР).

Зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника, разрезая его вдоль в среде дозированного количества 5% раствора глюкозы (в объеме 1 мл), предварительно подогретой до 37 °С. Далее отрезком отмытой резиновой трубки эпидидимис активно перемещали в течение 2 мин для освобождения от части сперматозоидов [6].

Для оценки жизнеспособности сперматозоидов на предметном стекле смешивали каплю гомогената с каплей 1% изотонического раствора эозина с помощью стеклянной палочки. Полученный препарат микроскопировали, подсчитывая на 200 клеток количество мертвых (окрашенных) сперматозоидов [7].

Также в камере Горяева производился подсчет сперматозоидов с учетом характера их подвижности. Подсчет производился в течение 1-го часа через каждые 15 мин, а затем через 30 мин до 240-й минуты включительно. Полученную взвесь эпидидимальных сперматозоидов хранили в термостате при 37 °С. Подвижность сперматозоидов определяли по общепринятой методике 4-балльной оценки сперматозоидов по характеру подвижности [8]: 0 - неподвижные, 1 - «дергающиеся» (колебательное, местное движение, когда имеется движение хвоста, но не происходит перемещения сперматозоидов, либо движение по круговой траектории), 2 - слабопо­движные (медленное прямолинейное движение) и 3 - прогрессивно подвижные (прямолинейное поступательное движение со спиральным вращением вокруг своей оси) сперматозоиды.

Для определения осмотической резистентности сперматозоидов изготавливалась шкала растворов хлорида натрия от 1,5 до 3,75% с интервалом 0,25% (штатив с пробирками). На предметные стекла с лунками помещали по 0,05 мл суспензии и вносили поочередно из каждой пробирки равное количество раствора, устанавливая концентрацию, при которой под микроскопом наблюдается полная остановка движения сперматозоидов [9].

Определение кислотной резистентности сперматозоидов проводили в чашке Петри, в которую помещали 1,5 мл суспензии, полученной из второго придатка. Затем по каплям прибавляли 0,1 н. раствор соляной кислоты до полного прекращения движения сперматозоидов, наблюдаемого под микроскопом. При этом регистрировали реакцию pH (с помощью pH-метра с микроэлектродом) [9].

Для оценки патологических форм сперматозоидов смешивали часть полученной суспензии с 1% раствором эозина Y в соотношении 1:10, затем спустя 30 мин готовили мазки, которые после просушивания на воздухе фиксировали метиловым спиртом и подвергали микроскопии [10]. Подсчитывалось на 200 клеток процентное содержание сперматозоидов с дефектами головки, шеи, средней части и хвоста [11].

Кроме того, в полученной эпидидимальной суспензии определялось суммарное количество сперматозоидов в единице объема (1 мл) [12].

Полученные цифровые данные обрабатывали на компьютере с использованием программы Statistica v.10.0. («Statsoft Inc.», США). Достоверность полученных результатов определялась при помощи непараметрического метода - критерия Манна-Уитни.

Прежде всего нами установлено, что у подопытных животных «алкогольной группы» содержание эпидидимальных сперматозоидов повышено по сравнению с интактными крысятами на 15,8%. Так, если у животных группы контроля данный показатель составил 44,2±3,88×10⁶ в 1 мл, то у крысят «алкогольной группы» исследуемый показатель составил 51,2±1,19×10⁶.

Другим показателем, существенно влияющим на фертильность, является жизнеспособность сперматозоидов. Зафиксировано увеличение количества мертвых сперматозоидов в гомогенате придатков мужских половых желез у животных «алкогольной группы» по сравнению с интактными самцами. Так, у животных контрольной группы содержание мертвых клеток составило 8,1±0,53%, в то время как у самцов из «алкогольной группы» - 20,2±0,76%.

О жизнеспособности эпидидимальных сперматозоидов также судили по характеру их двигательной активности, которую оценивали по общепринятой методике 4-балльной оценки, с последующим определением индекса подвижности сперматозоидов, отражающего отношение фертильных сперматозоидов к нефертильным в динамике. Фракцию фертильных сперматозоидов составляют прогрессивно подвижные и слабоподвижные половые клетки. Установлено, что у подопытных самцов содержание прогрессивно подвижных сперматозоидов на 1-й минуте исследования снижено по сравнению с интактными крысятами. Так, у интактных самцов данный показатель составил 26,65±1,342%, в то время как у животных «алкогольной группы» - 10,22±0,234%. Обращает на себя внимание, что на 15-й минуте исследования у подопытных крысят прогрессивно подвижные сперматозоиды отсутствуют в отличие от контрольных животных, у которых данный показатель составил 0,65±0,321%. При этом изменяется и содержание слабоподвижных сперматозоидов (табл. 1).

Как видно из табл. 1, у интактных животных в процессе наблюдения содержание слабоподвижных сперматозоидов постепенно снижается и достигает минимального значения на 120-й минуте исследования. В то же время у подопытных животных фракция слабоподвижных сперматозоидов сохраняется в клеточной суспензии только до 45-й минуты наблюдения. При этом содержание данной фракции сперматозоидов у подопытных крысят снижено по сравнению с интактными животными.

«Дергающиеся» и неподвижные сперматозоиды составляют нефертильную фракцию. Как видно из табл. 2, на всех сроках наблюдения количество «дергающихся» сперматозоидов у подопытных животных снижено по сравнению с контролем.

В процессе наблюдения количество неподвижных сперматозоидов постепенно возрастает по мере уменьшения числа сперматозоидов других фракций, при этом у подопытных животных данный показатель превышает таковой у интактных самцов в течение всего периода наблюдений (табл. 3).

Изменение содержания фертильных и нефертильных сперматозоидов у подопытных крысят об­условило изменение индекса подвижности половых клеток (табл. 4).

Определение кислотной и осмотической резистентности сперматозоидов позволяет нам оценить свойства биологических мембран данных клеток. В ходе исследования было установлено, что кислотная резистентность сперматозоидов у животных, рожденных от самок с хронической патологией гепатобилиарной системы, оказалась незначительно повышена по сравнению с интактными самцами. Так, у животных «алкогольной группы» сперматозоиды утрачивали подвижность при pH 2,7±0,05, в то время как у интактных животных - только при pH 2,5±0,01. Осмотическая резистентность у животных «алкогольной группы», напротив, оказалась сниженной по сравнению с самцами контрольной группы. Так, данный показатель составил 2,3±0,32% NaCl у животных «алкогольной группы», в то время как у интактных самцов - 3,5±0,07% NaCl.

Анализ количества патологических форм сперматозоидов показал значительное увеличение количества дегенеративных форм клеток в опытной группе (14,2±0,89) по сравнению с интактными животными (7,3±0,52).

Полученные данные свидетельствуют о развитии как дезадаптационных, так и адаптационных изменений со стороны мужской репродуктивной системы у экспериментальных животных. К последним можно отнести повышение концентрации сперматозоидов в гомогенате придатка у подопытных животных по сравнению с интактными. Подобные изменения, по всей видимости, отражают развитие неспеци­фических приспособительных реакций организма [13]. Аналогичные изменения, в частности, можно обнаружить в семенной жидкости при воздействии различных хронических стрессорных факторов [14]. Однако большинство изменений носит явный негативный характер. Ранее нами было показано, что у потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы наблюдается нарушение развития сперматогенного эпителия и сперматогенеза, что проявлялось уменьшением количества сустентоцитов, увеличением количества извитых семенных канальцев со слущенным эпителием и т.д. [15]. Наблюдаемые изменения морфологических и функциональных характеристик сперматозоидов могут быть следствием подобных нарушений, однако изменение кислотной и осмотической резистентности клеток может также свидетельствовать о развитии патологических процессов в придатках семенников экспериментальных животных [16].

В целом полученные результаты позволяют сделать заключение о снижении фертильности потомства самок крыс с экспериментальным поражением гепатобилиарной системы алкогольного генеза, о чем свидетельствует снижение двигательной активности и жизнеспособности сперматозоидов, изменение их кислотной и осмотической резистентности и увеличение количества дегенеративных форм.