Необходимость сохранения спермы в фертильном состоянии в течение некоторого времени возникла одновременно с первыми успешными попытками искусственной инсеминации (ИИ) у животных и человека.

Считается, что первый удачный опыт ИИ был выполнен Лазаро Спалланцани в 1774 г. на собаке [1]. Изучая природу и свойства спермы животных и человека, Спалланцани проводил многочисленные эксперименты, в том числе и по изучению влияния температуры на подвижность сперматозоидов. В трактате, изданном в 1803 г., Спалланцани описывает эксперимент по охлаждению спермы жеребца на снегу: «Наблюдая, что сперматозоиды (ориг. vermiculi) стали полностью неподвижными, я взял стекло со снега и оставил на воздухе при 81˚ (по Фаренгейту, 27,2 ˚С). Спустя 1 ч, я был изумлен, обнаружив, что все сперматозоиды ожили так, как если бы они были только что извергнуты из семенных пузырьков». Тот же результат был получен Спалланцани при охлаждении в течение 5—10 мин на снегу спермы быка и человека [2].

Хранение продуктов биологического происхождения часто ассоциируется с охлаждением, и не исключено, что опыты Спалланцани послужили первой научной основой для гипотермического сохранения спермы. Развитие и широкое применение технологии ИИ в конце XIX — начале XX веков, в основном благодаря работам русского ученого И.И. Иванова [1], потребовало совершенствования методов хранения спермы в течение времени, достаточного для транспортировки или для синхронизации гамет. К началу 40-х годов XX века были разработаны буферные растворы-разбавители на основе яичного желтка, позволяющие сохранять сперму млекопитающих при температурах около 5 ˚С в течение, как минимум, 3 сут [3, 4].

В 1949 г. С. Polge и соавт. [5] сообщили об успешной криоконсервации при –79 ˚С спермы человека, кролика и домашней птицы с использованием разбавителя на основе глицерина. Массовое промышленное производство жидкого азота после Второй мировой войны сделало привлекательной идею длительного хранения биологических объектов при сверхнизких температурах и способствовало развитию криобиологии. Криоконсервация становится господствующим подходом к сохранению спермы животных и человека, позволяя создавать криобанки и генетические коллекции, хранить материал неограниченно долго и транспортировать на большие расстояния.

Вместе с тем гипотермическое хранение спермы без замораживания не утратило актуальности, так как может более эффективно решать задачи, не связанные с длительным хранением материала. Значительно уступая криоконсервации по длительности, гипотермическое хранение обладает рядом преимуществ: не зависит от источника жидкого азота или сухого льда, не требует специального криологического оборудования, делает транспортировку безопасной и удобной.

Основной целью в разработке технологий гипотермического хранения спермы является увеличение длительности хранения без существенной потери фертильности. В настоящее время большинство известных подходов не позволяет сохранять сперму теплокровных животных в гипотермических условиях более нескольких дней. Между тем хорошо известно, что в организме млекопитающих зрелые сперматозоиды в неактивном состоянии способны сохраняться до нескольких недель при температуре окружающих тканей [6].

В 1996 г. группа исследователей Университета Йокогамы предложила новый способ хранения спермы при 4 °C в бессолевом водном растворе глюкозы и бычьего сывороточного альбумина (БСА) [7]. Консервирующая среда, названная авторами EFM (от англ. electrolyte free medium), позволяет сохранять сперму человека в жизнеспособном состоянии в течение, как минимум, 2 нед [7—10]. Наши исследования также подтверждают хорошую способность спермы человека к восстановлению подвижности и поддержанию целостности мембран при гипотермическом хранении в среде EFM [11].

Наряду с общими преимуществами гипотермическое хранение спермы в течение 1—2 нед открывает новые возможности при использовании в репродуктивной медицине. Метод позволяет пациенту-мужчине не присутствовать в день получения ооцитов, а сдать сперму заранее в любое удобное время, а также в случае необходимости осуществлять безопасную транспортировку.

В настоящей работе мы представляем опыт применения гипотермического хранения спермы в программах лечения бесплодия, а также данные о генетической безопасности и возможностях метода.

Применение гипотермического хранения спермы пациентов в программах лечения бесплодия. Краткосрочное гипотермическое хранение спермы, а также использование этой спермы для оплодотворения в 96 программах ЭКО/ICSI в 2010—2013 гг. применялось при наличии добровольного письменного информированного согласия. Средний возраст женщин составил 34,5±0,4 года, мужчин 38,0±0,8 года (n=96).

В 71 случае исходное состояние спермы было определено как нормоспермия или нормозооспермия, в 17 случаях — как тератозооспермия и в 8 — как олигозооспермия (в том числе в сочетании с другими патологическими характеристиками). Сперму считали пригодной для гипотермического хранения при общем количестве в эякуляте не менее 1 млн эффективных (прогрессивно-подвижных нормальной морфологии) сперматозоидов. Гипотермическое хранение не применялось при тяжелых патологических состояниях спермы, для которых прогрессивное снижение жизнеспособности сперматозоидов при хранении могло бы привести к утрате фертильности, — при тяжелой олигоастенотератозооспермии (ОАТ), криптозооспермии, а также для тестикулярных и эпидидимальных сперматозоидов.

Гипотермическое хранение и ревитализация спермы. Среда EFM представляет собой водный раствор 0,33 М глюкозы и 3% БСА [7]. Консервацию спермы в EFM, хранение и ревитализацию после хранения выполняли в соответствии с разработанным ранее протоколом [11]: 30—50 мкл отмытого осадка сперматозоидов, подготовленного с использованием набора SupraSperm System («Origio», Дания) в соответствии с инструкцией производителя, помещали в стерильные пробирки, добавляли по каплям 2 мл среды EFM и хранили при 4 °C. Для ревитализации после хранения образцы осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 300 g, удаляли консервант, растворяли осадок средой FertiCult IVF medium («FertiPro», Бельгия) до концентрации ~0,1 млн/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C в мультигазовом инкубаторе (5% CO2; 5% O2; 90% N2).

Оценка подвижности и жизнеспособности спермы. Для исследования жизнеспособности спермы по восстановлению подвижности после гипотермического хранения использовали 35 образцов капацитированной спермы, оставшейся после оплодотворения in vitro в программах ЭКО. Подвижность сперматозоидов определяли в соответствии с рекомендациями ВОЗ [12].

Анализ фрагментации ДНК. Для изучения фрагментации ДНК было использовано 6 образцов капацитированной спермы с исходным заключением «нормоспермия», оставшейся после оплодотворения in vitro в программах ЭКО. Анализ фрагментации ДНК по методу SCD-тест (англ. sperm chromatin dispersion) с использованием набора Halosperm («Halotech», Испания) в соответствии с инструкцией производителя выполняли после обработки спермы непосредственно перед консервацией и после гипотермического хранения в EFM в течение 14 сут.

Статистическая обработка. Данные представлены в виде M±SE, где М — среднее значение, SE — стандартная ошибка среднего. Для выявления связи между длительностью хранения спермы и частотой оплодотворения использовали непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Оценку различий во фрагментации ДНК до и после гипотермического хранения проводили по парному Т-критерию Вилкоксона. Расчеты и подготовка иллюстративного материала выполнены с использованием пакета программ Statistica 5.0 («StatSoft, Inc.») и Microsoft Excel.

Восстановление подвижности сперматозоидов. Одним из важнейших критериев жизнеспособности и фертильности спермы является восстановление подвижности после хранения, в особенности если предполагается проведение ИИ или оплодотворения in vitro путем совместной инкубации гамет.

Обработка спермы с использованием градиента плотности SupraSperm System обеспечивает присутствие в исходной суспензии не менее 80% прогрессивно-подвижных сперматозоидов [13]. Как и другие авторы [9, 10], мы принимали этот уровень за базовый при исследовании способности сперматозоидов к восстановлению подвижности в зависимости от длительности хранения (см. рисунок).

По данным нашего предыдущего исследования, после 2 нед хранения в EFM подвижность восстанавливали 56,2±5,0% (n=22) сперматозоидов [11]. В настоящей работе количество исследованных образцов было дополнено, таким образом, восстановление подвижности после 2 нед хранения составило 52,0±3,6% (n=35). После 4 нед хранения сперматозоиды все еще сохраняли подвижность (в среднем 12,9±3,8%, n=18), однако ее почти полная или полная утрата в некоторых случаях (линейная вариация Kd=104,9%) делает нецелесообразным дальнейшее хранение (см. рисунок).

Данные других авторов о прогрессивном снижении жизнеспособности сперматозоидов при гипотермическом хранении, неизбежно приводящем к ее полной утрате к 6—8-й неделе, тем не менее свидетельствуют о хорошей сохранности спермы в течение первых 2 нед.

Так, в одной из первых работ K. Saito и соавт. [7] использовали 31 образец спермы пациентов с нормоспермией (средняя подвижность 70,2%) и 19 с астенозооспермией (средняя подвижность 36%). Сперму обрабатывали с использованием градиента плотности Percoll, затем образцы были разбавлены средой EFM и хранились при температуре 4 ˚С. После 1, 2 и 4 нед хранения подвижность в среде Хэма F-10 восстановили соответственно 65,4, 40,4 и 5,5% сперматозоидов в группе с нормоспермией. В группе с астенозооспермией подвижность после 1 и 2 нед хранения восстановили 31,3 и 18,1% сперматозоидов.

По данным S. Quan и соавт. [14], после хранения в течение 2 нед в растворе EFM подвижность восстановили ~30% сперматозоидов. Авторы также приводят данные о восстановлении подвижности после хранения в течение 1 нед — 43,4±7,9%, но не указывают количество исследованных образцов.

В работе J. Riel и соавт. [10] после 1 нед хранения в среде EFM подвижность восстановили 27,6±5,0% сперматозоидов для нормоспермии (n=6) и 12,3±3,0% (n=6) — при патоспермии.

Таким образом, в совокупности с результатами других авторов наше исследование демонстрирует, что при гипотермическом хранении в течение, как минимум, 2 нед жизнеспособность спермы поддерживается на достаточно высоком для клинического использования уровне.

Генетическая безопасность. Среда EFM не содержит токсичных, генотоксических и мутагенных компонентов, несмотря на это, в процессе гипотермического хранения не исключено нарушение целостности генома сперматозоидов.

Оценку повреждений ДНК после хранения в течение 2 нед мы проводили методом SCD-тест с использованием коммерческих наборов Halosperm («Halotech», Испания). Для анализа были использованы образцы спермы, оставшейся после выполнения программ ЭКО, фертильность которых, таким образом, была подтверждена. Мы отмечали незначительное повышение SDF (индекс фрагментации ДНК сперматозоидов) после гипотермического хранения в течение 2 нед: 8,5±2,5 в исходных образцах и 11,2±3,1 после хранения, однако эти различия недостоверны по критерию Вилкоксона (T=1,5; n=6; p=0,11).

По данным авторов и разработчиков SCD-теста — J. Fernández и соавт. [15], индекс SDF в фертильной группе составил 16,3±6,0 (n=9), в группе с заключением «нормозооспермия» — 27,3±11,7 (n=46) и в группе с заключением «олигоастенотератозооспермия» — 47,3±17,3 (n=23). Сравнивая динамику повреждений ДНК при инкубации образцов свежей и размороженной донорской спермы, авторы наблюдали незначительное повышение фрагментации ДНК после криоконсервации: 14,3±3,3 для свежей обработанной спермы и 19,4±4,1 для размороженной и обработанной спермы (n=5) [16].

Таким образом, данные J. Fernández и соавт. [15, 16] также позволяют считать, что полученные нами значения SDF для спермы после гипотермического хранения являются допустимыми для нормальной фертильной спермы.

В 2011 г. ученые Гавайского университета J. Riel и соавт. [10] опубликовали данные о влиянии гипотермического хранения в среде EFM на частоту повреждений ДНК в сперматозоидах человека, полученные методом COMET. Авторы установили, что после 2 нед хранения уровень повреждений генома становится статистически значимым и к 5—6-й неделе выходит на плато. После 4 нед хранения в EFM и после криоконсервации уровень повреждений хроматина был почти одинаковым (длина «комет» 225,8±3,76 и 206,7±7,08 мкм соответственно), но после хранения в течение 1 нед в EFM уровень повреждений ДНК был значительно ниже по сравнению с криоконсервацией и сходен с таковым в исходных свежих образцах. Авторы указывают, что гипотермическое хранение может быть адаптировано для клинического применения [10].

Ранее (в 2007 г.) те же исследователи, используя в качестве модельного объекта мышь, сообщили о рождении здоровых мышат в результате применения метода гипотермического хранения спермы в EFM [9]. Эпидидимальные сперматозоиды мыши, хранившиеся в течение недели, были использованы для оплодотворения путем ICSI. Из 48 двухклеточных эмбрионов 27 (56%) достигли стадии бластоцисты. 25 бластоцист были перенесены в матку двум самкам, 19 (75%) эмбрионов имплантировались, в результате чего родились 9 здоровых мышат (36% от числа бластоцист). В этой же работе, инъецируя сперматозоиды человека в ооциты мыши для последующего хромосомного анализа, авторы установили, что хранение в течение 2 нед не оказывает негативного влияния на кариотип.

Эти исследования, как и полученные нами данные, убедительно показывают, что гипотермическое хранение спермы в EFM в течение, как минимум, 2 нед не оказывает значительного деструктивного воздействия на геном сперматозоидов.

Применение гипотермического хранения спермы в программах лечения бесплодия. В период с 2010 по 2013 г. краткосрочное гипотермическое хранение спермы было применено в 96 программах ВРТ. После ревитализации сперма была использована для оплодотворения методом ICSI.

В качестве предельного был установлен срок хранения 2 нед, при этом на практике средняя продолжительность хранения спермы до использования в программах редко превышала 5 сут (табл. 1). Связь между длительностью гипотермического хранения в пределах 2 нед и частотой нормального оплодотворения не выявлена (корреляция Спирмена, T=0,17; p=0,09; n=96).

В большинстве программ были перенесены эмбрионы на стадии бластоцисты. В 2 программах перенос отменен по причине отсутствия оплодотворения; в 6 программах — по медицинским показаниям, а эмбрионы заморожены на стадии морулы. Включая программы с отменой переноса, криоконсервация эмбрионов была выполнена в 21 (22%) программе. В 6 программах эмбрионы отставали в развитии и к моменту переноса (4—5-е сутки) находились на стадии 8—16 бластомеров или начала компактизации, отмечена выраженная фрагментация.

Во всех без исключения программах было перенесено в матку не более 2 эмбрионов.

Развивающаяся беременность, завершившаяся родами, была достигнута в 26 программах (табл. 2). В одной из программ исход беременности неизвестен из-за потери связи с пациентами. Многоплодная беременность была в 8 программах: 2 плодных яйца в 7 программах и 3 плодных яйца в одной.

Тридцать четыре ребенка (20 девочек и 14 мальчиков) родились в программах с применением гипотермического хранения спермы в среде EFM. Все рожденные дети здоровы.

Гипотермическое хранение спермы в безэлектролитном растворе EFM является технологически простой альтернативой криоконсервации в программах ЭКО в тех случаях, когда мужчина не может присутствовать в день пункции, но длительного хранения генетического материала не требуется. Метод позволяет сохранять сперму человека в течение, как минимум, 2 нед, обеспечивая хорошую сохранность подвижности и фертильности без существенных повреждений ДНК. Наш опыт применения гипотермического хранения спермы в программах ЭКО/ИКСИ демонстрирует высокую результативность в плане достижения беременности.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования — работа выполнена за счет средств Медицинской клиники репродукции МАМА.

Соответствие нормам этики

Выполненные в рамках представленной работы исследования соответствуют положениям и принципам Хельсинкской декларации 1975 г. (Seventh revision, 64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013). Применение вспомогательных репродуктивных технологий в программах лечения бесплодия, а также аналитические исследования биологического материала, полученного от пациентов, осуществлялись на основе подписанного добровольного информированного согласия. Представленные для публикации данные анонимны и не допускают раскрытия персональной информации. Дизайн и протокол исследования одобрены на заседании этического комитета Медицинской клиники репродукции МАМА от 12.10.10, протокол № 10−2.