Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) на сегодняшний день является распространенным методом вспомогательных репродуктивных технологий, задача которого состоит как в снижении риска рождения детей с наследственными заболеваниями, так и в повышении эффективности цикла ЭКО. Несмотря на некоторый уровень соответствия между внешним строением эмбрионов и их хромосомным статусом, оценка морфологических и морфокинетических параметров эмбриона не может в настоящее время заменить преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. Поэтому биопсия эмбриона является обязательной и незаменимой составляющей цикла ЭКО с ПГД [1—3]. Важность поставленных перед ПГД задач обусловливает необходимость создания надежной системы контроля качества всех этапов, от успешности проведения которых зависит как сама возможность проведения генетической диагностики, так и точность получаемых результатов.

Высокие воспроизводимые результаты биопсии эмбриологов разных клиник ЭКО могут быть достигнуты при идентичном высоком уровне подготовки специалистов и наличии сходного оборудования [4]. Качество выполнения биопсии критично для успеха протокола ЭКО с ПГД, поскольку в случае ошибки выполнение повторной биопсии может снизить жизнеспособность эмбриона и вероятность наступления беременности. Важным этапом во взаимодействии эмбриолога клиники ЭКО и лаборатории ПГД является тестовая биопсия. Последняя выполняется эмбриологом еще до проведения биопсии для ПГД и может служить одним из этапов контроля качества, позволяющим оценить вероятность возникновения ошибок при биопсии эмбрионов в дальнейшей работе. В настоящем исследовании представлены результаты проведения тестовых биопсий бластомеров и трофэктодермы. Качество выполнения тестовых биопсий было сопоставлено с качеством проведения биопсий для ПГД при дальнейшей работе эмбриологов. Целью настоящего исследования явилась оценка целесообразности выполнения тестовой биопсии перед биопсией для ПГД.

В рамках проведения тестовых биопсий 45 специалистами в 29 клиниках ЭКО в период с 2013 по 2016 г. был проанализирован материал 380 биоптатов: 250 образцов трофэктодермы и 130 образцов бластомеров. При проведении биопсий для ПГД от эмбриологов, успешно выполнивших тестовую биопсию, был получен 2001 образец: 1820 образцов трофэктодермы и 181 образец бластомеров. Образцы биопсии помещались в предоставленные генетической лабораторией пробирки с солевым фосфатным буфером (PBS), содержащим 1% поливинилпирролидон. Кроме материала биопсии, эмбриологи передавали в генетическую лабораторию образцы—контроли чистоты отмывки каждого биопсийного образца и контроль чистоты, предоставленного лабораторией буфера — отрицательный контроль.

Биопсия бластомеров и/или трофэктодермы выполнялась согласно рекомендациям, полученным из генетической лаборатории. Рекомендации касались необходимости предоставления контролей проведения биопсии, маркировки образцов, правил заполнения сопроводительных документов. Доставленные в генетическую лабораторию образцы биопсийного материала подвергались полногеномной амплификации с помощью набора SurePlex DNA Amplification System («Illumina», США). Далее продукт полногеномной амплификации оценивался с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле и/или измерением концентрации ДНК на флюориметре. Для приготовления агарозного геля использовали агарозу TopVision Agarose Tablets («ThermoScientfic», США) и 1X трис-ацетатный буфер TAE. В случае измерения концентрации ДНК пользовались флюориметром Qubit 2.0 («Invitrogen», CША) и набором реагентов Qubit dsDNA HS. Статистическая обработка данных проводилась в программе Microsoft Excel 2010 с использованием критерия χ².

Всего в выполнении тестовых биопсий приняли участие 45 эмбриологов из 29 клиник ЭКО. В результате тестовой биопсии от каждого эмбриолога были получены образцы биопсийного материала, контроли чистоты отмывки каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли) и контроль чистоты транспортировки и хранения предоставленного генетической лабораторией буфера (для этого одна из предоставленных пробирок с буфером остается невскрытой и отправляется в лабораторию вместе с остальными образцами). Нами была проведена полногеномная амплификация всех образцов, переданных каждым эмбриологом, а также внутрилабораторных контролей чистоты и надежности используемых реагентов (внутренний положительный и отрицательный контроль). При последующем электрофорезе или измерении концентрации ДНК оценивалось качество проведенной биопсии: наличие продукта амплификации в образцах с биопсийным материалом и его отсутствие в контролях отмывки к каждому образцу. Также учитывалось соответствующее качество прохождения внутренних контролей генетической лаборатории и контроля чистоты предоставленного лабораторией буфера для биопсийного материала. Результаты успешно выполненной тестовой биопсии представлены на рис. 1.

Из 45 специалистов, принявших участие в тестовой биопсии, 39 получили удовлетворительные результаты с первого раза. Остальным эмбриологам, показавшим отсутствие биопсийного материала в образце и/или загрязненный контроль в 3 и более из 8 предоставленных образцов, было предложено пройти повторную тестовую биопсию после обсуждения возможных причин полученных результатов. Двое из специалистов прошли тестовую биопсию повторно, получив успешные результаты. Данные о прохождении повторной тестовой биопсии еще 4 эмбриологами отсутствуют.

Нами были проанализированы частоты возникновения ошибок в ходе выполнения биопсии — отсутствие материала биопсии в предоставленном образце и контаминация отмывочных капель. Возникновение ошибок при выполнении тестовой биопсии трофэктодермы наблюдалось несколько реже, чем при биопсии бластомеров (рис. 2). Однако различия в частоте возникновения ошибок между двумя группами биопсийного материала оказались статистически незначимыми при имеющемся объеме выборок (χ²=2,991 для частоты амплификации и χ²=3,508 для контаминации).

Далее были проанализированы результаты работы (наличие биопсийного материала в передаваемых на анализ образцах и чистота отмывочных капель) эмбриологов, успешно выполнивших тестовую биопсию. При проведении биопсий для ПГД чаще мы сталкивались с проблемой отсутствия биопсийного материала, чем с контаминацией (рис. 3). Причем отсутствие амплификации при биопсии бластомеров наблюдалось достоверно чаще, чем при работе с трофэктодермой (χ²=6,687 при p=0,01). Для контаминации не было обнаружено статистически значимой разницы при работе с разным типом биопсийного материала при имеющемся объеме выборок (χ²=1,031).

Если сравнить между собой представленные ранее значения частот возникновения ошибок при тестовых биопсиях и биопсиях для ПГД, то можно отметить следующие различия (рис. 4). Отсутствие амплификации трофэктодермы встречалось достоверно реже при биопсиях для ПГД, чем во время проведения тестовых биопсий (χ²=4,742 при p=0,05). То же касалось и контаминации, частота которой была достоверно ниже при биопсиях для ПГД, чем при тестовых биопсиях, что было справедливо для обоих типов биопсийного материала (χ²=28,588 для биопсии трофэктодермы и χ²=29,933 для биопсии бластомеров при p=0,01). Таким образом, мы наблюдали более высокое качество выполнения биопсий для ПГД по сравнению с качеством выполнения тестовых биопсий.

Тестовая биопсия, как начальный этап взаимодействия эмбриолога клиники ЭКО и лаборатории ПГД, является важным звеном в системе контроля качества проведения эмбриологического этапа ПГД. Следование предоставляемым генетической лабораторией инструкциям по проведению биопсии эмбриона — ключевой момент, позволяющий унифицировать процесс биопсии и обеспечить соблюдение необходимых этапов контроля качества. Для проведения биопсий важно использовать пробирки с буфером, предоставляемые лабораторией ПГД, в задачи которой входит осуществление этапа контроля чистоты каждой новой партии буфера. Предварительное проведение тестовой биопсии позволяет выявить проблемные моменты в технике биопсии и отмывки биоптата. Что обеспечивает возможность сформулировать для эмбриолога соответствующие рекомендации по устранению возможных причин неудачного результата. Таким образом, эмбриолог получает своевременную обратную связь от генетической лаборатории еще до выполнения биопсии для проведения ПГД. Полученные нами статистически значимые различия между качеством выполнения тестовых биопсий и биопсий для ПГД могут быть следствием своевременно полученных указаний на имеющиеся проблемы при выполнении тестовой биопсии и рекомендаций по их устранению. Тестовые биопсии обеспечивают необходимый минимальный уровень квалификации специалистов, работающих с биоптатом. Таким образом, тестовые биопсии, как и остальные этапы контроля качества ПГД, направлены на повышение точности проводимой генетической диагностики и надежности получаемых результатов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дата подачи рукописи: 21.04.17.