В настоящее время препараты прогестерона и его аналоги широко используются в акушерско-гинекологической практике для лечения эндокринных форм бесплодия, устранения угрозы прерывания беременности, фармакотерапии недостаточности лютеиновой фазы менструального цикла, лечения и профилактики гиперплазии эндометрия, эндометриоза, а также в качестве заместительной гормонотерапии у женщин с физиологической и патологической аменореей [1].

Фармакотерапия вышеперечисленных заболеваний проводится длительное время и часто является комбинированной. Помимо гинекологической, у женщин может быть диагностирована коморбидная патология, требующая лечения, поэтому вероятен риск развития межлекарственных взаимодействий, опосредованных, в том числе, и применением препаратов прогестерона.

Учитывая существенную роль белка-транспортера гликопротеина-P (Pgp) в возникновении межлекарственных взаимодействий, FDA (Food and Drug Administration) рекомендует тестировать новые лекарственные препараты на принадлежность к субстратам, ингибиторам и индукторам данного транспортера [2].

Гликопротеин-Р (Pgp, ABCB1-белок) – белок-переносчик с широкой субстратной специфичностью, удаляющий из клетки вещества различной химической природы. Он локализуется в кишечнике, печени, почках, эндотелиальных клетках капилляров гистогематических барьеров (в мозге, семенниках, плаценте и других тканях). Белок-транспортер препятствует всасыванию, участвует в тканевом распределении и выведении с мочой и желчью веществ, являющихся его субстратами [3, 4].

Группы лекарственных средств, которые транспортирует Pgp, включают антиаритмические средства, гипотензивные препараты, антиагреганты и антикоагулянты, сердечные гликозиды, статины, антибактериальные средства (макролиды, цефалоспорины, фторхинолоны), ингибиторы ВИЧ-протеиназы, стероидные гормоны, иммунодепрессанты, противоопухолевые препараты, флюоресцентные красители и др. [3, 4].

Функциональная активность Pgp может изменяться (повышаться или снижаться) под воздействием ряда факторов, в том числе и лекарственных веществ. При совместном применении субстратов Pgp с его ингибиторами (верапамил, амиодарон, карведилол, кетоконазол и др.) концентрация субстратов в плазме крови повышается, что может привести к развитию нежелательных лекарственных реакций. И, наоборот, совместный прием субстратов и индукторов белка-транспортера (рифампицин, дексаметазон, тироксин и др.) приводит к снижению концентрации субстратов в крови и, как следствие, к уменьшению их терапевтической эффективности [3, 4].

В изученной литературе обнаружены исследования по влиянию прогестерона на функциональную активность и экспрессию Pgp in vitro [3—6]. Однако, являясь гормоном, прогестерон способен воздействовать на функционирование белка-транспортера опосредованно, за счет изменения гормонального фона и метаболических процессов, поэтому актуальным является изучение влияния прогестерона на функциональную активность Pgp in vivo. Установление принадлежности прогестерона к ингибиторам или индукторам белка-транспортера позволит прогнозировать развитие межлекарственных взаимодействий, опосредованных препаратами прогестерона.

Цель исследования — изучить влияние прогестерона на функциональную активность Pgp на уровне целостного организма.

Работа выполнена на 23 половозрелых кроликах-самках (3—3,5 кг) породы шиншилла. Животные были получены из питомника ОАО «Касимов-Миакро», имели необходимые ветеринарные свидетельства и содержались в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.16). Все животные были разделены на четыре группы. Кроликам 1-й (контрольная) группы (n=5) проводилась «ложная операция» — вскрытие кожных покровов и подкожной жировой клетчатки передней брюшной стенки с последующим послойным ушиванием раны. Кроликам 2-й группы (n=6) проведена овариэктомия. Животным 3-й группы (n=6) проведена овариэктомия и с 15-х суток после оперативного вмешательства вводили прогестерон (утрожестан, «Besins Healthcare», Бельгия) перорально в дозе 2 мг/кролик 1 раз в день в течение 4 нед [8]. Кроликам 4-й группы (n=6) выполняли овариэктомию и с 15-х суток после операции вводили прогестерон по указанной выше схеме в дозе 15 мг/кролик [8]. Овариэктомию и «ложную» операцию выполняли в условиях операционной вивария РязГМУ под наркозом: внутримышечное введение ксилазина гидрохлорида (рометар, «СПОФА», Чехия) в дозе 4,0—6,0 мг на 1 кг массы и золетила-50 («Virbac», Франция) в дозе 5—10 мг на 1 кг массы.

За 7 дней до начала исследования, на 14, 28 и 42-е сутки после операции у животных всех групп определяли функциональную активность Pgp и концентрацию половых гормонов (тестостерона, эстрадиола, прогестерона) в сыворотке крови.

Функциональную активность Pgp оценивали по фармакокинетике маркерного субстрата фексофенадина (аллегра, «Sanofy Aventis», Франция) после его однократного перорального введения в дозе 67,5 мг на 1 кг массы в виде суспензии на воде очищенной (5 мл/кролик) [9, 10]. Для определения концентрации фексофенадина кровь (5 мл) забирали из краевой вены уха кролика в гепаринизированные пробирки через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 ч после введения препарата. Образцы крови центрифугировали, полученную плазму хранили до анализа при –29 °С в течение месяца. Концентрацию фексофенадина в плазме крови кроликов определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе Стайер с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104 (Россия) с применением обращенно-фазовой хроматографической колонки Ultrasphere 4,6×250 мм (зернение 5 мкм) фирмы «Beckman Coulter» по методике Г.В. Раменской и соавт. в собственной модификации [9—11].

С использованием модельнонезависимого метода [12] рассчитывали следующие фармакокинетические параметры фексофенадина: C_max – максимальная концентрация (нг/мл); AUC_0—t – площадь под фармакокинетической кривой концентрация—время от нуля до времени последнего забора крови (нг·ч/мл); Сl — общий клиренс (л/ч).

Концентрацию половых гормонов определяли в ЦНИЛ РязГМУ радиоиммунологическим методом с применением стандартной тест-системы производства IMMUNOTECH (Чехия) с дальнейшей обработкой полученных результатов на анализаторе «Иммунотест» (Россия).

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы StatSoft Statistica 7.0 (США). Достоверность различий между показателями гормонального статуса животных оценивали с помощью критерия Фридмана. При наличии статистической значимости парные сравнения выполняли по критерию Вилкоксона. Полученные результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей. Статистическую значимость различий между фармакокинетическими параметрами фексофенадина оценивали исходя из представления о лог-нормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фармакокинетических параметров проводили с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) после их логарифмирования. Различия с исходными показателями внутри групп и межгрупповые сравнения выполняли по критерию множественного сравнения Фишера. Полученные результаты (фармакокинетический параметр) представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Дополнительно рассчитывали двусторонний 90% доверительный интервал (ДИ) отношения средних геометрических фармакокинетических параметров фексофенадина на фоне воздействия (овариэктомия, введение прогестерона) к параметрам интактных животных (внутри групп), а также 90% ДИ отношения средних геометрических фармакокинетических параметров фексофенадина на фоне воздействия (введение прогестерона) к параметрам животных, подвергнутых овариэктомии. Согласно U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, значимыми считаются различия между фармакокинетическими параметрами, если двусторонний 90% ДИ их отношения находится за пределами диапазона 0,8—1,25 (80—125%), поскольку изменение фармакокинетических параметров только более чем на 25% может привести к изменению фармакодинамики препаратов [2].

Содержание половых гормонов (тестостерон, прогестерон и эстрадиол) в сыворотке крови у животных различных групп до начала эксперимента достоверно не различалось.

У кроликов 1-й группы на фоне «ложной операции» гормональный статус существенно не изменялся на протяжении всего исследования.

У животных 2-й группы на фоне овариэктомии по сравнению с исходными показателями выявлено значимое уменьшение уровня эстрадиола на 42-е сутки эксперимента — на 29,7% (p<0,05) (рис. 1),

У кроликов 3-й группы (прогестерон в дозе 2 мг/кролик после овариэктомии) по сравнению с показателями у животных до овариэктомии концентрация эстрадиола также уменьшалась на 42-е сутки исследования (28-е сутки введения прогестерона) — на 18,2% (p<0,05) (см. рис. 1). Содержание прогестерона снижалось на 14-е сутки овариэктомии на 28% (p<0,05), увеличивалось на 28-е сутки эксперимента (14-е сутки введения прогестерона) на 32,0% (p<0,05) по сравнению с дооперационными показателями и нормализовалось, достоверно не отличаясь от исходных значений, на 42-е сутки (28-е сутки введения прогестерона) (см. рис. 2).

У кроликов 4-й группы (прогестерон в дозе 15 мг/кролик после овариэктомии) содержание эстрадиола достоверно не отличалось от показателей у животных до овариэктомии на протяжении всего исследования (см. рис. 1). Концентрация прогестерона снижалась на 14-е сутки эксперимента на 44,7% (p<0,05), увеличивалась на 28-е сутки (14-е сутки введения прогестерона) в 13,2 раза (p<0,05), на 42-е сутки (28-е сутки введения прогестерона) в 8,3 раза (p<0,05) по сравнению с показателями до операции (см. рис. 2).

При этом у кроликов, которым вводили прогестерон в высокой дозе (15 мг/кролик), содержание эстрадиола в сыворотке крови было выше показателей серии овариэктомии на 28-е сутки эксперимента (14-е сутки введения прогестерона) на 44,7% (p<0,05), на 42-е сутки (28-е сутки введения прогестерона) на 59% (p<0,05). Возможно, это связано с превращением прогестерона в эстрогены в надпочечниках [13]. Концентрация прогестерона у кроликов, которым вводили прогестерон в малой дозе (2 мг/кролик), превосходила показатели серии овариэктомии на 28-е сутки эксперимента (14-е сутки введения прогестерона) на 217,3% (p<0,05), на 42-е сутки (28-е сутки введения прогестерона) на 134,4% (p<0,05), у животных, получавших прогестерон в дозе 15 мг/кролик, — в 20,2 и 10,3 раза (p<0,05) соответственно.

Содержание тестостерона у животных исследуемых групп на протяжении всего эксперимента достоверно не изменялось.

Функциональную активность Pgp оценивали по фармакокинетике его маркерного субстрата — фексофенадина. Фексофенадин — антигистаминное средство 3-го поколения, которое не подвергается биотрансформации и выводится из организма с помощью Pgp, поэтому его фармакокинетика зависит от функционирования данного белка-транспортера. Накопление фексофенадина в организме кроликов (повышение C_max и AUC_0—t) и снижение его выведения (уменьшение Cl) свидетельствуют об уменьшении функциональной активности Pgp на уровне целостного организма и наоборот.

Фармакокинетические параметры фексофенадина у животных всех четырех групп до начала исследования достоверно не различались (см. таблицу).

В группе «ложнооперированных» животных параметры фармакокинетики фексофенадина достоверно не отличались от исходных показателей (до проведения «ложной операции») на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует об отсутствии изменения функционирования Pgp на уровне целостного организма.

У животных 2-й группы на 14-е сутки овариэктомии происходило повышение C_max фексофенадина в 1,61 раза (90% ДИ 1,09; 2,38; p=0,039), AUC_0—t — в 1,56 раза (90% ДИ 1,08; 2,24; p=0,05) и уменьшение Cl в 0,325 раза (90% ДИ 0,12; 0,95; p=0,036) по сравнению с исходными значениями. На 28-е сутки эксперимента отмечалось снижение Cl в 0,52 раза (90% ДИ 0,31; 0,87; p=0,07) по сравнению с параметрами до оперативного вмешательства. На 42-е сутки после овариэктомии выявлено повышение C_max фексофенадина в 2,43 раза (90% ДИ 1,87; 3,15; p=0,0008), AUC_0—t — в 2,24 раза (90% ДИ 1,53; 3,28; p=0,0017) и уменьшение Cl в 0,37 раза (90% ДИ 0,17; 0,82; p=0,06) (см. таблицу) по сравнению со значениями до операции. Полученная динамика фармакокинетических параметров фексофенадина свидетельствует о его накоплении в организме кроликов (повышение C_max и AUC_0—t) и замедлении выведения (уменьшение Cl), что характеризует уменьшение функциональной активности Pgp. При этом максимальные и клинически значимые различия (90% ДИ отношения средних геометрических фармакокинетических параметров фексофенадина у животных после овариэктомии к параметрам интактных животных находится вне диапазона 0,8—1,25) были получены на 42-е сутки овариэктомии.

У животных 3-й группы на 14-е сутки после овариэктомии отмечалось увеличение C_max фексофенадина в 1,3 раза (90% ДИ 1,09; 1,55; p=0,0038), AUC_0—t — в 1,77 раза (90% ДИ 1,36; 2,32; p=0,0026), уменьшение Cl в 0,48 раза (90% ДИ 0,31; 0,75; p=0,0019) по сравнению с исходными показателями. На 28-е сутки эксперимента (14-е сутки введения прогестерона в дозе 2 мг/кролик) C_max фексофенадина увеличивалась в 1,17 раза (90% ДИ 0,95; 1,44; p=0,066) по сравнению с параметрами до операции. На 42-е сутки эксперимента (28-е сутки введения прогестерона в дозе 2 мг/кролик) выявлено повышение C_max в 1,17 раза (90% ДИ 1,05; 1,29; p=0,065), а Cl уменьшался в 0,68 раза (90% ДИ 0,49; 0,92; p=0,063) по сравнению со значениями до овариэктомии.

На 42-е сутки исследования (28-е сутки введения прогестерона в дозе 2 мг/кролик) C_max фексофенадина у кроликов, получавших низкую дозу прогестерона (2 мг/кролик), была ниже соответствующего показателя серии овариэктомии в 0,45 раза (90% ДИ 0,30; 0,68; р=0,0038), AUC_0—t в 0,45 раза (90% ДИ 0,28; 0,72; р=0,0086), Cl превышал его в 2,13 раза (90% ДИ 1,09; 4,21; р=0,068), данные различия были клинически значимыми (90% ДИ вне диапазона 0,8—1,25).

Полученные результаты свидетельствуют, что прогестерон в низкой дозе стимулирует Pgp на уровне целостного организма, но недостаточно для восстановления его исходной активности. Возможно, для полного восстановления функциональной активности белка-транспортера до исходного уровня необходимо дополнительно вводить эстрадиол. Сниженное содержание эстрадиола в сыворотке крови у кроликов 3-й группы подтверждает данную гипотезу.

У животных 4-й группы на 14-е сутки после оперативного вмешательства отмечалось увеличение C_max в 1,87 раза (90% ДИ 0,99; 3,49; p=0,023), AUC_0—t в 2,06 раза (90% ДИ 1,10; 3,86; p=0,009) и уменьшение Cl в 0,3 раза (90% ДИ 0,14; 0,64; p=0,023). На 28-е сутки эксперимента (14-е сутки введения прогестерона) в дозе 15 мг/кролик) Cl снижался в 0,25 раза (90% ДИ 0,07; 0,84; p=0,01) по сравнению со значениями до овариэктомии. На 42-е сутки исследования фармакокинетические параметры фексофенадина достоверно не отличались от значений до операции, даже имелась тенденция к уменьшению C_max и AUC_0—t фексофенадина по сравнению с исходными показателями.

У кроликов, которые получали высокую дозу прогестерона (15 мг/кролик), на 42-е сутки эксперимента C_max фексофенадина была ниже аналогичного показателя серии овариэктомии в 0,27 раза (90% ДИ 0,18; 0,41; р=0,00005), AUC_0—t в 0,29 раза (90% ДИ 0,18; 0,46; р=0,00026), Cl превышал его в 2,8 раза (90% ДИ 1,43; 5,52; р=0,017). При этом данные различия были клинически значимыми (90% ДИ вне диапазона 0,8—1,25).

Полученные результаты показывают, что при введении прогестерона в высокой дозе активность Pgp повышалась до исходного, дооперационного уровня.

Таким образом, овариэктомия приводит к снижению сывороточной концентрации прогестерона и эстрадиола, что сопровождается уменьшением функциональной активности Pgp на уровне целостного организма и, как следствие, может привести к увеличению концентрации его субстратов в крови, их накоплению и проявлению побочных эффектов. Введение прогестерона повышает сниженную функциональную активность Pgp. При этом с повышением дозы прогестерона (от 2 до 15 мг/кролик) усиливается его индуцирующее действие.

Поскольку прогестерон повышает функциональную активность белка-транспортера, при его комбинировании с субстратами Pgp возможно снижение эффективности проводимой фармакотерапии за счет ускорения выведения субстратов Pgp из организма. Учитывая данный фактор, может потребоваться корректировка доз назначаемых препаратов — субстратов белка-транспортера — в сторону их увеличения. Гипотеза требует подтверждения в клинических исследованиях.

Работа поддержана грантом РФФИ 16−04−00320 а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Щ., Е.Я.

Сбор и обработка материала — И.Ч., П.М.

Статистическая обработка — А.Щ.

Написание текста — А.Щ., И.Ч.

Редактирование — Е.Я.

*e-mail: alekseyshulkin@rambler.ru