Основной задачей в культивировании эмбрионов человека in vitro является получение максимального количества жизнеспособных эмбрионов, пригодных к тому, чтобы наступила беременность, завершающаяся рождением здорового ребенка. Поэтому усилия специалистов лабораторий экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) направлены на поиск оптимальных условий культивирования эмбрионов, в том числе химического состава среды, и устранение негативных факторов.

Исследования показывают, что некоторые формы бесплодия вызваны нарушениями в работе механизмов образования или утилизации активных форм кислорода (АФК), что приводит к окислительному стрессу на уровне как тканей и органов, так и организма. Свободнорадикальное окисление является одной из причин, приводящих к нарушениям в развитии эмбрионов in vitro. Так, описана защитная роль антиоксидантов в средах для созревания ооцитов [1] и культивирования эмбрионов [2—5].

Обнаружено, что мелатонин, основной гормон эпифиза и регулятор суточных ритмов, обладает мощной антиоксидантной активностью [6]. Выяснено также, что он содержится в преовуляторной фолликулярной жидкости человека в концентрациях, в 3 раза превышающих таковую в сыворотке крови [7—9]. Таким образом, мелатонин в фолликулярной жидкости может играть физиологическую роль в созревании ооцита, оплодотворении и раннем развитии эмбрионов.

Известно положительное влияние мелатонина на процесс созревания яйцеклеток и развития эмбрионов in vitro у различных видов животных [10—12]. Однако концентрации мелатонина в средах для созревания яйцеклеток и культивирования эмбрионов существенно (в тысячи раз, от наномолей до микромолей) отличаются, они также разнятся в одних и тех же средах для эмбрионов различных видов животных. Максимальная концентрация мелатонина (как производной аминокислоты триптофана) в представленной работе определялась концентрацией добавляемых в питательные среды аминокислот, содержание которых измеряется десятыми долями миллимоля.

Цель исследования — cравнить развитие предымплантационных эмбрионов человека при культивировании in vitro в среде с различным содержанием мелатонина.

В данном проспективном исследовании оценивали следующие показатели: частоту развития эмбрионов до 4-, 8-клеточной стадии, стадии компактизации и формирования бластоцист в период со 2-го по 6-й день эмбрионального развития.

Исследование проводили на базе клиники ООО ЭКО ЦЕНТР (Москва). Критерии включения пациенток в исследование: возраст от 22 лет до 41 года включительно (средний возраст — 31,4 года), отсутствие генетических факторов бесплодия в анамнезе, отсутствие тяжелых форм патозооспермии у партнера, индукция суперовуляции (ИСО) с использованием антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона, получение во время пункции фолликулов 14 ооцитов и более на стадии MII.

Эмбрионы-сибсы от 241 пары, проходящей лечение бесплодия методами ЭКО, получены при помощи ICSI или IMSI Hoffman modulation (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида, морфологически отобранного с использованием системы хоффмановского модуляционного контраста) [13, 14], разделены на группы: контрольная группа (общее число эмбрионов — 1945) — культивирование проводили в среде Global («LifeGlobal Group», Бельгия); 1-я опытная группа (n=540) — в среде Global, содержащей 10^–9 M мелатонина (M5250−1G, «Sigma», США); 2-я опытная группа (n=370) — в среде Global + 10^–6 M мелатонина; 3-я опытная группа (n=874) — в среде Global + 10^–4 M мелатонина.

Стимуляция яичников. ИСО проводили в протоколе с использованием антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона со 2—3-го дня менструального цикла с использованием рекомбинантных и/или мочевых гонадотропинов в суточной дозе 150—300 М.Е. Овуляцию инициировали введением хорионического гонадотропина в дозе 10 000 МЕ за 34—36 ч до пункции фолликулов.

Получение ооцитов. Аспирацию фолликулов выполняли под внутривенным наркозом. Ооциты, окруженные слоем клеток кумулюса, получали в результате трансвагинальной пункции фолликулов под контролем с применением ультразвукового исследования спустя 34—36 ч после введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина.

Подготовка спермы. Подвижные сперматозоиды отбирали путем осаждения в 2-ступенчатом градиенте плотности в среде ALLGrad («LifeGlobal Group», Бельгия), отмывки и осаждения в среде ALLGrad Wash («LifeGlobal Group», Бельгия), после чего для отбора сперматозоидов использовали метод «swim up».

Оплодотворение. Для оплодотворения полученных ооцитов применяли процедуру ICSI или IMSI Hoffman modulation [13, 14]. Клетки кумулюса удаляли мягким пипетированием («Flexipet. Cook») спустя 3—4 ч после забора ооцитов, используя раствор гиалуронидазы («LifeGlobal Group», Бельгия). Процедура ICSI/IMSI Hoffman modulation выполнена через 1—2 ч после денудации на инвертированном микроскопе Leitz Fluovert FU («Wild Leitz GmbH», Германия) с использованием системы хоффмановского модуляционного контраста и комплекта микроманипуляторов Narishige («Narishige», Япония).

Культивирование эмбрионов. Культивирование осуществляли в СО₂-инкубаторе при температуре 37 °C в увлажненной атмосфере с 7,3% СО₂. Через 18 ч после оплодотворения зиготы-сибсы каждой пациентки случайным образом разделяли на группы: эмбрионы группы контроля культивировали в среде LifeGlobal, эмбрионы опытных групп — в среде Global с добавлением 10^–9, 10^–6 или 10^–4 M мелатонина). Эмбрионы культивировали индивидуально в микрокаплях под слоем минерального масла. На 3-и сутки после оплодотворения производили замену среды на аналогичную свежую. Все среды для культивирования содержали 5 мг/мл белка (LifeGlobal Protein Supplement. «LifeGlobal Group», Бельгия).

Оценка качества эмбрионов. Зиготы и эмбрионы индивидуально оценивали под микроскопом через 18, 45, 72 и 96 ч после оплодотворения для оценки их развития и качества. На 5—6-е сутки развития производили оценку качества сформировавшихся бластоцист по D. Gardner [15].

Криоконсервирование и размораживание эмбрионов. Криоконсервирование эмбрионов во всех сравниваемых группах проводили с использованием набора для витрификации Vitrification Kit (101) («Cryotech», Япония); размораживание — с использованием набора Warming Kit (102) («Cryotech», Япония). Процедуры выполняли согласно протоколам фирмы-производителя.

Перенос эмбрионов и оценка беременности. Размораживание криоконсервированных эмбрионов проводили непосредственно в день переноса эмбриона (ПЭ). Клиническую беременность определяли по наличию плодного яйца в полости матки, копчико-теменному размеру плода 2—4 мм и регистрации сердцебиения при ультразвуковом исследовании на 5-й неделе после ПЭ.

Статистический анализ. Результаты исследований представлены в виде M±SD. Статистическую обработку выполняли с использованием t-критерия Стьюдента для зависимых выборок. Для обработки данных получения клинической беременности при использовании свежих или криоконсервированных эмбрионов использовали критерий χ².

В исследовании 241 пациентке проводили цикл ИСО с последующей пункцией ооцитов. При культивировании эмбрионов-сибсов в среде Global и Global + 10^–9 M и 10^–6 M мелатонина не обнаружено существенных различий в развитии эмбрионов до предымплантационных стадий. Однако по сравнению с контролем в среде, содержащей 10^–4 М мелатонина, наблюдалось улучшение эмбрионального развития с увеличением доли компактных эмбрионов на 4-й день (45,95 и 39,09% соответственно; p<0,005), формированием бластоцист хорошего качества на 5-й день развития (23,94 и 19,56% соответственно; p<0,05) и общим выходом бластоцист хорошего качества (41,37 и 35,88% соответственно; p<0,005). Данные представлены в табл. 1.

Полученные на эмбриологических этапах ЭКО бластоцисты хорошего качества (2—5АА, АВ, ВА, ВВ) перенесены в полость матки (на 5-е сутки) либо криоконсервированы (на 5—6-е сутки развития).

После переноса размороженного эмбриона или в цикле ИСО для каждой из групп проведена оценка частоты наступления клинической беременности. Среднее количество эмбрионов на перенос составило 1,0 для каждой из групп. Анализ полученных данных показал, что частота наступления клинической беременности при ПЭ в «свежем» цикле достоверно не отличалась для всех опытных и контрольных групп. Однако при переносе размороженного эмбриона для группы эмбрионов, культивируемых в среде с 10^–9 М мелатонина, обнаружено статистически значимое повышение частоты наступления клинической беременности по сравнению с группой контроля (58,1 и 42,2% соответственно; p<0,05). Данные представлены в табл. 2.

Недавние исследования показали, что мелатонин является достаточно сильным и нетоксичным антиоксидантом, который может быть использован в комплексной терапии бесплодия у женщин. Негативное влияние окислительного стресса при применении вспомогательных репродуктивных технологий все чаще освещается в литературе, особенно в отношении ЭКО. Применение программ ЭКО может приводить к увеличению негативного действия АФК на ооциты и эмбрионы, которое начинается еще до извлечения ооцитов [16]. Гормональная терапия во время стимуляции яичников приводит к значительным изменениям в химическом составе фолликулярной жидкости in vivo, в особенности это касается уровня эндогенных антиоксидантов [17]. Кроме того, ооциты в условиях in vitro не защищены фолликулярной жидкостью, обладающей антиоксидантной активностью, что делает их более чувствительными к окислительному стрессу [18—20].

Ооциты и эмбрионы также могут подвергаться воздействию высоких концентраций атмосферного кислорода при культивировании в инкубаторах и во время манипуляций на разных этапах ЭКО [21]. Более высокие концентрации атмосферного кислорода по сравнению с его содержанием в жидкости яйцевода в условиях in vivo приводят к избыточному образованию АФК, и положительный эффект мелатонина более заметен на ооцитах, подвергшихся окислительному стрессу [11].

Многие исследователи [12, 10, 22] отметили положительное влияние мелатонина на жизнеспособность и развитие при культивировании свиных, мышиных и коровьих эмбрионов in vitro.

N. Rodriguez-Osorio и соавт. [12] обнаружили положительный эффект мелатонина, оказываемый на общее количество клеток в бластоцисте, и этот эффект предположительно обусловлен его антиапоптозным действием. В исследованиях K. Papis и соавт. [11] показано, что при добавлении мелатонина в среду для культивирования эмбрионов увеличивается эффективность развития последних до стадии бластоцисты. По данным S. Cos и соавт. [23], оптимальные показатели развития эмбрионов до стадии бластоцисты наблюдались в случае использования физиологических концентраций мелатонина, которые колебались в пределах от 10^–9 до 10^–6 М мелатонина в среде культивирования.

Показано, что свободнорадикальное окисление приводит к повреждению ДНК, оказывая отрицательное влияние на оплодотворяемость и развитие эмбрионов [24], а также повышая уровень выкидышей и негативно влияя на исход беременности [25].

Мелатонин является эффективным агентом, предотвращающим повреждение митохондриальной ДНК вследствие увеличения эффективности транспорта электронов в митохондриях, что снижает образование АФК [26]. В некоторых ситуациях мелатонин оказывается более эффективным антиоксидантом, чем специфические антиоксиданты митохондрий [27], и эта особенность может быть использована в лечении бесплодия, а также с целью улучшения качества яйцеклеток, получаемых в циклах ЭКО.

J.-T. Kang и соавт. [4] исследовали влияние мелатонина в среде для дозревания ооцитов свиньи in vitro. Выявлены значительное снижение уровня АФК и бóльшая доля зрелых ооцитов MII в группе, где использовался мелатонин, однако улучшения развития эмбрионов до стадии бластоцисты и увеличения количества клеток в бластоцисте не отмечено.

В исследованиях по дозреванию in vitro яйцеклеток различных видов животных найден оптимальный диапазон концентрации мелатонина в среде (от 10^–9 до 10^–6 М), причем как более высокие, так и более низкие концентрации последнего приводили к негативным эффектам [28, 29]. Эти данные согласуются с результатами исследований по дозреванию яйцеклеток человека, которые показали, что 10^–9—10^–5 М мелатонина в культуральных средах улучшают ядерное созревание ооцитов MI [1], увеличивают долю имплантации и незначительно повышают долю клинических беременностей [30].

Данные настоящего исследования согласуются с приведенными результатами, полученными зарубежными коллегами, и дополняют их. Несмотря на то что нам не удалось обнаружить статистически значимой разницы в предымплантационном развитии эмбрионов человека при концентрации мелатонина в среде культивирования 10^–9 и 10^–6 М, зафиксированы его положительные эффекты при концентрации 10^–4 М. Однако для группы эмбрионов, культивируемых в среде с 10^–9 М мелатонина, обнаружено статистически значимое повышение частоты наступления клинической беременности после переноса размороженного эмбриона.

Использование 10^–4 М мелатонина в среде для культивирования in vitro эмбрионов человека позволяет улучшить эмбриональное развитие до преимплантационных стадий. Культивирование эмбрионов с 10^–9 М мелатонина увеличивает частоту наступления клинической беременности после переноса размороженного эмбриона. Мелатонин в физиологических и супрафизиологических концентрациях в среде для культивирования не оказывает видимого токсического воздействия на развитие предымплантационных эмбрионов человека, вплоть до концентрации 10^–4 М. Возможно, его действие в разной степени является дозозависимым не только для разных видов животных, но и внутри одного вида при дозревании ооцитов или культивировании эмбрионов in vitro.

Использование столь различных (10^–9—10^–4 М) и относительно высоких (10^–4 М) концентраций мелатонина в культивировании эмбрионов может указывать на то, что мелатонин способен проявлять свое действие не только посредством связывания со своими рецепторами (МТ1 и МТ2) и как антиоксидант, но также, вероятно, вовлекаться в энергетический и/или пластический обмен эмбриона.

Исходя из этого, необходимо проведение дальнейших исследований для более детального понимания механизмов действия мелатонина на уровне гамет, эмбрионов и организма, а также для подтверждения его оптимальной эффективной концентрации при культивировании эмбрионов in vitro.

Благодарность. Авторы выражают благодарность и глубокую признательность врачу-репродуктологу Наталии Всеволодовне Князевой за советы и ценные замечания при работе над данной статьей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А., К.К., Е.С., С.Я.

Сбор и обработка материала — К.К., М.Х., М.Т., И.Е., Е.К., Т.Х., А.С., Н.В., А.Б., А.Б., А.К., Е.С., А.М., Е.С.

Статистическая обработка — К.К., А.М.

Написание текста — К.К.

Редактирование — В.А., С.Я.

Финансирование: Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №14-50-00029).

*e-mail: altravita@mail.ru