Профилирование микроРНК и мРНК в тканях эутопического и эктопического эндометрия при эндометриоидных кистах яичников

Авторы:
  • Е. С. Филиппова
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • Н. А. Межлумова
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • А. М. Гамисония
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • Ч. М. Эльдаров
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • М. В. Кузнецова
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • Д. Ю. Трофимов
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • С. В. Павлович
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • И. Ф. Козаченко
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • М. Ю. Бобров
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
  • Л. В. Адамян
    ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
Журнал: Проблемы репродукции. 2019;25(2): 27-45
Просмотрено: 914 Скачано: 142

В структуре гинекологической заболеваемости эндометриоз занимает 3-е место после воспалительных заболеваний половых органов и миомы матки. Эндометриоз характеризуется формированием гетеротопий, включающих эпителиальные и стромальные клетки эндометрия, за пределами матки. Очаги эндометриоза имеют разнообразную локализацию и обнаруживаются в ретроцервикальной клетчатке и ретровагинальной перегородке, на брюшине, матке, яичнике, мочевом пузыре, прямой кишке и аппендиксе [1]. Эндометриоидные кисты яичников выявляются у 17—44% женщин репродуктивного возраста, больных эндометриозом [2]. Эндометриоз, как причина бесплодия, занимает 2-е место после воспалительных заболеваний матки и придатков. Почти 40% больных с эндометриоидными кистами яичников сталкиваются с проблемами бесплодия [3]. Несмотря на высокую распространенность эндометриоза, этиология и патофизиология этого заболевания и ассоциированного с ним бесплодия до сих пор до конца не изучены. Во многом это связано с тем, что эндометриоз является многофакторным, полигенным заболеванием. Остается также неясным, почему у одних пациентов развитие эндометриоидной кисты не оказывает существенного влияния на функцию яичника, тогда как у других приводит к снижению овариального резерва (ОВР). Возникновение бесплодия связывают с наличием дистрофических процессов в гранулезных клетках фолликулов, изменением состава фолликулярной жидкости, с повышенным апоптотическим индексом клеток гранулезы и дегенерацией ооцитов [3]. Данные изменения могут происходить в яичнике в результате развития эндометриоидных гетеротопий, что приводит к формированию патологического микроокружения, способствующего снижению репродуктивной функции. Молекулярные механизмы, лежащие в основе снижения ОВР при эндометриозе яичников, остаются недостаточно исследованными [4].

В последнее время активно изучается роль малых некодирующих РНК в регуляции экспрессии генов как в норме, так и при патологии. Наиболее изученными представителями малых некодирующих РНК являются микроРНК (мкРНК), которые играют роль посттранскрипционных репрессоров за счет взаимодействия с мишенями матричной РНК (мРНК), что приводит либо к деградации соответствующей мРНК, либо к остановке трансляции [4, 5]. По некоторым оценкам, мкРНК способны регулировать экспрессию более 60% генов, кодирующих белок, и участвуют в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, воспаления, апоптоза, гемопоэза, эмбрионального развития и онкогенеза [6]. МикроРНК могут действовать дистанционно за счет транспорта к клеткам-мишеням в составе микровезикул и экзосом. Так, например, мкРНК, секретируемые эпителиальными клетками эндометрия, могут иметь большое значение при развитии эндометриоза, поскольку их гены-мишени участвуют в формировании клеточных контактов и миграции, а также в сигнальных путях, запускаемых активацией рецепторов ряда факторов роста, что поддерживает процессы пролиферации и выживания клеток эндометрия [7]. Таким образом, изменение экспрессии мкРНК может способствовать как дальнейшему развитию патологического очага, так и вовлечению окружающих тканей в патологический процесс. Поскольку ткани кисты интимно сращены с тканями яичника, можно предположить, что специфические изменения экспрессии генов и мкРНК в тканях кисты могут отражать как течение патологического процесса, так и особенности взаимодействия тканей эктопического эндометрия и тканей яичника.

В этой связи в данной работе проведена сравнительная оценка экспрессии мкРНК и мРНК в тканях эндометриоидных кист яичника относительно тканей эутопического эндометрия как при нормальном, так и низком ОВР. На основании полученных данных проведен биоинформационный анализ сигнальных путей и процессов, регулируемых дифференциально экспрессируемыми генами и мкРНК.

Цель исследования — определить различия экспрессии микроРНК и матричной РНК (мРНК) в тканях эндометриоидных кист яичника и эутопическом эндометрии. При помощи биоинформационного анализа оценить роль дифференциально экспрессирующихся РНК в патогенезе эндометриоза яичников.

Материал и методы

Сбор биоматериала

В исследование вошли две группы пациенток репродуктивного возраста с эндометриоидными кистами яичников, низким и нормальным ОВР. Оценку ОВР проводили по результатам количественного анализа крови на антимюллеров гормон и фолликулостимулирующий гормон, а также на основании ультразвукового исследования.

Образцы тканей эутопического и эктопического эндометрия отбирали в ходе хирургического вмешательства. У всех пациенток получено информированное согласие на использование биоматериала для исследований. План и методика сбора биоматериала утверждены этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова».

Полученные образцы тканей эндометрия разделили на две части, одну из них мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили далее в биобанке при температуре –80 °С, оставшуюся часть образца отправляли в патоморфологическую лабораторию для гистологического исследования. Материал для дальнейших этапов работы отбирали на основании результатов клинических исследований, протокола хирургического вмешательства и гистологического заключения, подтверждающего наличие эпителиального и стромального компонентов в тканях эктопического эндометрия. В исследовании использовали ткани эндометрия, собранные в пролиферативную фазу менструального цикла (6—10-й день цикла).

Выделение РНК

Из образцов собранных тканей выделяли фракции суммарной РНК, содержащие мкРНК, с использованием коммерческих наборов miRNeasy Micro Kit и RNeasy MinElute Cleanup Kit («Qiagen», США) по методике, рекомендуемой производителем. Качество выделенных фракций оценивали при помощи микроэлектрофореза на чипах на приборе Bioanalyzer 21000 («Agilent Technologies», США).

Секвенирование микроРНК

Библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) из выделенных образцов РНК готовили с использованием наборов NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina («New England Biolabs», Германия) по методикам, рекомендованным производителем. Секвенирование проводили на платформе Illumina NextSeq с использованием реагентов и расходных материалов фирмы «Illumina, Inc» США (NextSeq 500/550 High Output v2 kit). Качественный и количественный анализ библиотек проводили при помощи микроэлектрофореза («Agilent Technologies», США) и флуорометрии (Qubit, «Thermo Fisher Scientific», Россия).

Качество секвенирования оценивали при помощи сервиса BaseSpace («Illumina, Inc.», США) по следующим параметрам: плотность кластеров, интенсивность сигнала в каналах детекции, доля кластеров, прошедших фильтр по выходу выровненных прочтений. Все параметры не выходили за пределы допустимых значений.

Анализ экспрессии генов

Выделенную из тканей эндометрия тотальную РНК также использовали для исследования экспрессии генов, которое проводили при помощи реактивов и расходных материалов для микроматричного анализа на чипах GeneChip Human Gene 2.0 ST по методике производителя на приборе GeneChip TG scanner (Affymetrix, «Thermo Fisher Scientific», США).

Оценка экспрессии мкРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

Выделенная из тканей РНК, включающая мкРНК, преобразована в кДНК с использованием набора miScript II RT («Qiagen», Германия) по протоколу производителя. Для приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР использовали набор miScript SYBR Green PCR Kit («Qiagen», Германия). Реакцию проводили в термоциклере CFX96 («Bio-Rad Laboratories Inc.», США) в следующей последовательности: 15 мин при температуре 95 °C, затем 40 циклов по 15 с при температуре 94 °C, по 30 с при оптимизированной температуре отжига (52—60 °С) и по 30 с при температуре 70 °C. В качестве эндогенного контроля для образцов ткани использовали SNORD68.

Анализ данных

Полученные в результате секвенирования последовательности нуклеотидов проходили процедуру удаления адаптеров с последующим выравниванием на базу данных мкРНК miRBase версии 21 (http://mirbase.org). Для оценки представленности каждой мкРНК проводили нормализацию на миллион прочтений в библиотеке. Анализ дифференциальной экспрессии выполнялся в среде R с помощью пакета DeSeq2. Для всех групп сравнения в модель включалась информация о принадлежности к группе и для парных образцов дополнительно информация о пациенте, от которого был забран материал. Поиск мРНК-мишеней для мкРНК проводился с помощью базы валидированных взаимодействий miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw). Отбор мишеней проводился на основании информации о валидации взаимодействий двумя и более методами, в результате получали списки только тех генов-мишеней, для которых регуляторная роль мкРНК экспериментально доказана. Анализ экспрессии генов выполняли с помощью программы Transcriptome Analysis Console («Agilent Technologies», США). Обогащение по путям внутриклеточной сигнализации и биологических процессов по базе данных KEGG (http://www.genome.jp) и Wikipathways (http://www.wikipathways.org) проведено при помощи программы Cytoscape 3.4.09 и плагина JEPETTO10.

Результаты

Оценка ОВР

В исследование включены пациентки в возрасте от 18 до 37 лет с эндометриоидными кистами яичников. Оценку ОВР проводили по результатам количественного анализа крови на антимюллеров гормон и фолликулостимулирующий гормон, а также на основании ультразвукового исследования с подсчетом количества антральных фолликулов (табл. 1).

Таблица 1. Состояние овариального резерва женщин репродуктивного возраста с эндометриоидными кистами яичников до хирургического лечения Примечание. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения M±SD или абсолютного числа больных (%); χ2 — критерий Пирсона; * — p<0,001. ЭКЯ — эндометриоидные кисты яичников; АМГ — антимюллеров гормон; ФСГ — фолликулостимулирующий гормон; УЗИ — ультразвуковое исследование.
На основании изучения ОВР до хирургического лечения выделены две группы: пациентки с нормальным и низким ОВР.

Всем пациенткам выполнены лапароскопия, энуклеация кист яичников, а также гистероскопия и биопсия эндометрия. В ходе оперативного вмешательства получены образцы тканей эндометриоидных кист яичников и эутопического эндометрия. Для дальнейшего транскриптомного анализа отобраны образцы, собранные в пролиферативную фазу менструального цикла.

Исследование экспрессии мкРНК в тканях эндометрия при низком и нормальном ОВР

Проведен анализ экспрессии мкРНК в тканях эндометриоидных кист яичника и эутопического эндометрия при низком (L) и нормальном (N) ОВР. Анализ экспрессии мкРНК в эктопическом (EcL) эндометрии кисты относительно эутопического (EuL) при низком ОВР выявил 15 дифференциально экспрессируемых мкРНК (дэ-мкРНК) с пониженной экспрессией в тканях кисты (рис. 1, а).

Рис. 1. Дифференциальная экспрессия микроРНК в эктопическом эндометрии овариальных кист относительно эутопического эндометрия при низком (а) и нормальном (б) овариальном резерве. Представлены 10 микроРНК с повышенной и пониженной экспрессией, отобранные на основании параметров кратности изменений (Log2FC) и вероятности ошибки (p-value).
При сравнении образцов тканей пациенток с нормальным ОВР (EcN-EuN) выявлено 100 дэ-мкРНК, среди которых 66 демонстрировали повышенную, а 34 — сниженную экспрессию в тканях эндометриоидной кисты яичника (см. рис. 1, б). Значительные различия в количестве дэ-мкРНК свидетельствуют о существенном дисбалансе регуляторных процессов в тканях эндометрия при различных типах ОВР. Пересечение полученных списков дэ-мкРНК при низком и нормальном резерве выявило 3 мкРНК (hsa-miR-129−2-3p, hsa-miR-129−5p, hsa-miR-615−3p), характерных только для низкого ОВР, и 12 одинаковых мкРНК: hsa-miR-1−3p, hsa-miR-127−5p, hsa-miR-136−3p, hsa-miR-145−5p, hsa-miR-202−5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-29c-5p, hsa-miR-508−3p, hsa-miR-509−3-5p, hsa-miR-514a-3p, hsa-miR-708−5p. При этом экспрессия одинаковых для групп сравнения мкРНК имела разнонаправленный характер: снижалась при низком, и повышалась при нормальном ОВР.

Данный характер изменений также подтверждается сниженной экспрессией указанных мкРНК в тканях кисты при низком ОВР, что установлено при сравнении экспрессии в эктопическом эндометрии при низком ОВР и нормальном ОВР (EcL-EcN). Показано, что экспрессия всех указанных выше мкРНК значительно снижена в кисте при низком ОВР (EcL). При этом в данном сравнении наблюдалось 50 дэ-мкРНК с пониженной экспрессией и 14 мкРНК с повышенной экспрессией в тканях кисты при низком ОВР (рис. 2, а).

Рис. 2. Дифференциальная экспрессия микроРНК в эктопическом (а) и эутопическом (б) эндометрии при низком овариальном резерве относительно нормального. Представлены 10 микроРНК с повышенной и пониженной экспрессией, отобранные на основании параметров кратности изменений (Log2FC) и вероятности ошибки (p-value).
Кроме этого, при сравнении экспрессии указанных выше мкРНК в эутопическом эндометрии (EuL-EuN) наблюдалось повышение их уровня при низком ОВР (см. рис. 2, б). Всего в данном сравнении наблюдалось 36 дэ-мкРНК с повышенной и 23 с пониженной экспрессией в эутопическом эндометрии при низком ОВР. Таким образом, при сравнительном анализе наблюдаемые различия в экспрессии могут быть одновременно связаны как со снижением экспрессии в эктопическом эндометрии, так и с повышением в эутопическом эндометрии.

Для дэ-мкРНК в тканях эктопического и эутопического эндометрия получены списки валидированных генов-мишеней, которые использовали при обогащении по базам данных молекулярных взаимодействий. Проведенный анализ позволил выявить 24 клеточных процесса и сигнального пути. Особенно заслуживают внимания сигнальные пути, активируемые эстрогенами, фолликулостимулирующим гормоном, лептином, пролактином, тиреотропином и серотонином. Кроме этого, выделена группа сигнальных путей, регулируемых различными интерлейкинами (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9), которые могут вносить существенный вклад в воспалительные процессы при развитии эндометриоидных гетеротопий (табл. 2). Определены также клеточные процессы, связанные с канцерогенезом, ангиогенезом и дифференцировкой. Особого внимания заслуживает обогащение по сигнальному пути регуляции репарации ДНК с участием мкРНК (miRNAs involved in DDR, DNA damage response). Активация данного сигнального пути может свидетельствовать о повышении уровня повреждений ДНК вследствие развития воспаления и окислительного стресса в тканях эктопического эндометрия. С данными патологическими процессами, по-видимому, связано выявление сигнального пути, ассоциированного с аутофагией и клеточным старением.

Таблица 2. Анализ сигнальных путей и процессов, реализуемых при участии генов-мишеней дифференциально экспрессируемыми микроРНК в тканях эктопического и эутопического эндометрия Примечание. Гены/путь — указано количество генов-мишеней дифференциально экспрессируемых микроРНК в сигнальном пути (1-я цифра) и общее количество генов в сигнальном пути (2-я цифра); q-value — вероятность ошибки в формировании сигнального пути. Ec — эктопический эндометрий; Eu — эутопический эндометрий; N — нормальный овариальный резерв; L — низкий овариальный резерв. ФСГ — фолликулостимулирующий гормон; TGF-β — трансформирующий фактор роста β.

Таблица 2. Анализ сигнальных путей и процессов, реализуемых при участии генов-мишеней дифференциально экспрессируемыми микроРНК в тканях эктопического и эутопического эндометрия Примечание. Гены/путь — указано количество генов-мишеней дифференциально экспрессируемых микроРНК в сигнальном пути (1-я цифра) и общее количество генов в сигнальном пути (2-я цифра); q-value — вероятность ошибки в формировании сигнального пути. Ec — эктопический эндометрий; Eu — эутопический эндометрий; N — нормальный овариальный резерв; L — низкий овариальный резерв. ФСГ — фолликулостимулирующий гормон; TGF-β — трансформирующий фактор роста β.

Транскриптомный анализ экспрессии генов в тканях эндометрия

Для выявления особенностей экспрессии генов проведен транскриптомный анализ в ряде парных образцов эктопический (Ec) — эутопический (Eu) эндометрий, полученных от пациенток с эндометриозом в пролиферативную фазу менструального цикла при низком и нормальном ОВР. Образцы РНК, использованные для оценки экспрессии генов, включали также образцы РНК, полученные для секвенирования мкРНК.

В результате анализа получены списки дифференциально экспрессированных мРНК, распределение которых по образцам представлено на рис. 3.

Рис. 3. Транскриптомный анализ экспрессии генов в тканях эндометрия. N — нормальный овариальный резерв; L — низкий овариальный резерв; Ec — эктопический эндометрий; Eu — эутопический эндометрий.
При сравнении эктопического и эутопического эндометрия при нормальном ОВР (см. рис. 3, N Ec/Eu) показана дифференциальная экспрессия 2491 гена, из которых 1363 гена с пониженной и 1128 генов с повышенной экспрессией. При аналогичном сравнении при низком ОВР различия в экспрессии значительно менее выражены: всего выявлено 100 генов, из которых 53 с пониженной и 47 с повышенной экспрессией в тканях кисты (см. рис. 3, L Ec/Eu). В эктопическом эндометрии овариальных кист при низком ОВР относительно нормального выявлено 1358 дэ-мРНК: 699 с повышенной и 659 с пониженной экспрессией (см. рис. 3, Ec L/N).

Различия между тканями эутопического эндометрия оказались менее выраженными, всего выявлено 56 дифференциально экспрессируемых генов, из которых 35 с пониженной и 21 ген с повышенной экспрессией (см. рис. 3, Eu L/N). Таким образом, как и в случае с мкРНК, наблюдается выраженное снижение количества дифференциально экспрессированных генов в эктопическом эндометрии относительно эутопического при низком ОВР.

Для определения возможного участия наборов генов во внутриклеточных каскадах проведен биоинформационный анализ с использованием обогащения сигнальных путей и процессов по базе данных Wikipathways. Для селекции сигнальных путей и взаимодействий использован ряд параметров: количество идентифицированных генов в сигнальном пути, XD-фактор и p-value. XD-фактор — параметр, оценивающий, насколько выражено участие списка генов в том или ином сигнальном пути, находящемся в сети молекулярных взаимодействий. Положительные и более высокие значения XD-фактора свидетельствуют о более вероятной ассоциации найденных сигнальных путей с выбранной группой генов. Параметрp-value оценивает вероятность ошибки в расчете XD-фактора.

Для дифференциально экспрессированных генов, идентифицированных при сравнении эктопического эндометрия овариальных кист и эутопического эндометрия, было отобрано 208 сигнальных путей на основании значений p<0,05. Далее на основании значений XD-фактора и количества генов в сигнальном пути (n>5) из полученного списка отобрано 72 пути (табл. 3). В табл. 3 указано общее количество генов в пути и количество генов в сигнальном пути с повышенной (↑) и пониженной (↓) экспрессией. Отбор по указанным параметрам выявил биологические сигнальные пути, ассоциированные с опухолевыми процессами, иммунными реакциями, регуляцией клеточного цикла, дифференцировки, окислительного стресса.

Таблица 3. Клеточные сигнальные пути и процессы, регулируемые дифференциально экспрессируемыми генами Примечание. ↑↓ — направление экспрессии генов; XD-фактор оценивает выраженность участия списка генов в сигнальном пути; p-value — вероятность ошибки в расчете XD-фактора.

Таблица 3. Клеточные сигнальные пути и процессы, регулируемые дифференциально экспрессируемыми генами Примечание. ↑↓ — направление экспрессии генов; XD-фактор оценивает выраженность участия списка генов в сигнальном пути; p-value — вероятность ошибки в расчете XD-фактора.

Установлены также внутриклеточные каскады, запускаемые рецепторами факторов роста, ядерными рецепторами и реализующиеся при участии MAPK, PI3K-Akt, mTOR, Wnt сигнальных путей.

На основании полученных списков генов отобрано 47 сигнальных путей, в состав которых входили гены-мишени дэ-мкРНК, выявленные на предыдущем этапе. Гены, их белковые продукты, функции, а также мкРНК, для которых они являются мишенями, представлены в табл. 4.

Таблица 4. Гены-мишени дифференциально экспрессируемых микроРНК, выявленные в результате транскриптомного анализа
Указано также количество сигнальных путей, частью которых является тот или иной ген. Из представленных генов с повышенной экспрессией можно отметить AKT3, кодирующий протеинкиназу В, которая встречается в 11 сигнальных путях, стимулирующих пролиферацию. Среди генов с пониженной экспрессией можно отметить ТР53, входящий в состав 15 сигнальных путей, продуктом которого является белок р53, индуцирующий остановку клеточного цикла, апоптоз, и являющийся онкосупрессором.

Среди белковых продуктов генов-мишеней можно выделить транскрипционные факторы, регуляторы клеточного цикла, онкогены, факторы клеточной адгезии (см. табл. 3). Данный набор эффекторов способен обеспечить многоуровневую регуляцию клеточной пролиферации, миграции и дифференцировки. На основании полученных данных можно заключить, что изменение экспрессии мкРНК может служить дополнительным фактором, участвующим в развитии патологических процессов при эндометриозе.

Обсуждение

В результате проведенного исследования установлено существенное изменение экспрессии мкРНК в эктопическом и эутопическом эндометрии при нормальном ОВР (100 дэ-мкРНК). Важно отметить, что при низком ОВР отличия в экспрессии мкРНК между Ec и Eu были менее выражены (15 дэ-мкРНК). Можно предположить, что в основе наблюдаемых изменений экспрессии мкРНК при низком и нормальном ОВР существенную роль играет изменение гормонального контроля функций эндометрия со стороны патологически измененных яичников. В пользу этого также свидетельствуют выявленные отличия в экспрессии мкРНК в парах сравнения одной локализации (EcL-EcN, EuL-EuN) при низком и нормальном ОВР. Изменение состава и направления экспрессии ряда мкРНК может оказывать влияние на экспрессию их генов-мишеней в эктопическом эндометрии, что в свою очередь может как стимулировать прогрессирование эндометриоза, так и оказывать дополнительное негативное действие на ОВР за счет модулирования гормонозависимых сигнальных путей и сигнальных каскадов, сопряженных с воспалением. Влияние эстрогенов и прогестерона на экспрессию мкРНК показано в ряде работ с использованием как культивируемых клеток эндометрия, так и клеток, полученных в пролиферативную и секреторную фазу цикла [8, 9]. Помимо локализации в пределах одной клетки, мкРНК потенциально могут действовать дистанционно за счет секреции в составе экзосом. Установлено, что экзосомы содержат микроРНК, мРНК и белки, способные модулировать иммунные реакции, выживание и дифференцировку клеток [10]. Экзосомы эпителиальных и стромальных клеток эндометрия содержат мкРНК, мишенями которых являются молекулы клеточной адгезии, компоненты внутриклеточного каскада Jak-STAТ и сигнальных путей VEGF и Toll-подобных рецепторов [7]. При этом экзосомы эндометрия могут участвовать как в процессе имплантации, обеспечивая коммуникацию между клетками стенки матки и эмбрионом, так и формировании гетеротопий за счет влияния на активность резидентных клеток в месте развития очага [11]. В ряде работ показано участие некоторых мкРНК в индукции апоптоза клеток гранулезы и замедлении созревания ооцитов [12, 13]. Можно предположить, что мкРНК, секретируемые в составе экзосом клетками эктопического эндометрия, могут влиять на овариальную функцию за счет изменения сигнальных каскадов в клетках яичника. Таким образом, дисбаланс в экспрессии мкРНК в тканях кисты при нормальном ОВР может способствовать прогрессированию патологического процесса, развитие которого усиливает токсическое действие на ткани яичника. Постепенное снижение функции яичника в результате этого воздействия приводит к переключению клеточного гомеостаза на гормоннезависимые регуляторные каскады (Wnt, Notch, Hedghog, Tgfb). Этому также может способствовать снижение экспрессии гормончувствительных регуляторных мкРНК как в эктопическом, так и эутопическом эндометрии. Отсутствие регуляторных влияний приводит к нарушению процессов пролиферации, дифференцировки, воспаления в тканях эндометрия, что может способствовать токсическому действию на ткань яичника со стороны кисты, а также приводить к нарушению децидуализации и снижению рецептивности эутопического эндометрия. В совокупности указанные факторы могут вносить весомый вклад в развитие бесплодия у больных эндометриозом яичников.

Транскриптомный анализ мРНК также показал значительное снижение количества дифференциально экспрессируемых генов в эктопическом эндометрии относительно эутопического при низком ОВР, что свидетельствует о менее выраженных различиях на уровне транскрипции между эктопическим и эутопическим эндометрием при снижении функции яичников. На основании анализа количества дифференциально экспрессированных генов в эутопическом эндометрии при низком и нормальном резерве можно предположить, что снижение функции яичников в меньшей степени сказывается на формировании различий в экспрессии генов в тканях данной локализации. При этом сравнение экспрессии генов в эктопическом эндометрии при разных типах ОВР показало наличие выраженных различий между тканями овариальных кист. Таким образом, в зависимости от состояния ОВР могут наблюдаться существенные изменения в экспрессии мкРНК и мРНК, что необходимо учитывать при формировании групп сравнения в дальнейших исследованиях эндометриоза.

При помощи биоинформационного анализа продемонстрировано, что изменение паттернов экспрессии мкРНК и мРНК в эутопическом и эктопическом эндометрии может приводить к дисбалансу внутриклеточных каскадов и способствовать развитию эндометриоза. Установлено, что гены, идентифицированные в парах сравнения Ec/Eu при низком и нормальном ОВР, входят в состав 10 сигнальных путей, задействованных в опухолевом процессе, и 4 сигнальных путей, участвующих в регуляции клеточного цикла. Обращает на себя внимание обогащение по сигнальным путям, связанным с повреждением и репарацией ДНК (7 путей). Данное наблюдение свидетельствует о дестабилизации генетического аппарата в клетках эктопического эндометрия, что может быть связано с генотоксическим действием окислительного стресса. Гены, участвующие в клеточных ответах на повышение уровня реактивных форм кислорода, также были выявлены в результате проведенного анализа (см. табл. 2). Сходные результаты получены при обогащении списков генов-мишений дэ-мкРНК. Выявлено несколько сигнальных путей, обеспечивающих регуляцию адаптивного ответа клеток в условиях окислительного стресса (см. табл. 2: DNA damage response (ATM), Senescence and Autophagy, Keap1-Nrf2 Pathway, miRNAs involved in DDR). Одним из факторов развития окислительного стресса является процесс воспаления, наличие которого в очагах эндометриоза хорошо известно. Транскриптомный анализ выявил гены, участвующие в воспалительных реакциях, клеточных ответах при стимуляции IL-1, а также при активации системы комплимента (см. табл. 3). На уровне мишеней мкРНК также показаны сигнальные пути, связанные с воспалительным ответом и внутриклеточными каскадами, реализуемыми при участии интерлейкинов (IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9), а также при активации системы комплимента. Недавно показано разнонаправленное изменение содержания интерлейкинов IL-2, IL-5, IL-7, IL-9 в тканях эктопического эндометрия относительно эутопического. В частности, наблюдались повышение уровня IL-2 и снижение содержания IL-5, IL-7, IL-9, а также снижение количества антагониста рецептора IL-1 (IL-1ra) в тканях эктопического эндометрия [14]. В другом исследовании [15] наблюдалось повышение экспрессии рецептора IL-1 типа I в эндометриоидных очагах, что может свидетельствовать в пользу дисрегуляции клеточных ответов, запускаемых IL-1, в очаге воспаления. Так, IL-1 может индуцировать секрецию IL-6 фибробластами, эндотелиальными клетками и циркулирующими моноцитами [16] и может стимулировать секрецию IL-8 клетками эндометрия [17]. Активация сигнальных путей IL-6 и IL-8 способствует развитию воспаления за счет стимуляции миграции и активации лейкоцитов. Продукция IL-6 клетками эндометрия повышается в ответ на стимуляцию эстрогенами, уровень которых увеличивается в ответ на действие IL-1 и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) [18]. IL-6 играет важную роль в процессах воспаления за счет активации Т-лимфоцитов и стимуляции дифференцировки В-клеток.

IL-1 также может стимулировать экспрессию циклооксигеназы-2 (СОХ-2), в результате чего повышается продукция простагландина Е2 (PGE2). Повышение экспрессии рецептора IL-1 и снижение экспрессии его антагониста могут приводить к гиперэкспрессии СОХ-2 в тканях эндометрия, что было подтверждено в ряде работ [19, 20]. Синтез и секреция PGE2 могут дополнительно стимулировать экспрессию СОХ-2, кроме того, PGE2 способен индуцировать продукцию ароматазы, которая является ключевым регуляторным ферментом в биосинтезе эстрогенов [21]. Таким образом, синтез PGE2 обеспечивает на локальном уровне поддержание повышенного содержания простаноидов и эстрогенов. PGE2 также способен повышать фагоцитарную активность иммунных клеток и стимулировать ангиогенез через увеличение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [21], что дополнительно способствует выживанию клеток эндометриоидных гетеротопий. Указанные наблюдения согласуются с полученными нами данными об участии дифференциально экспрессированных генов и генов-мишеней мкРНК в путях биосинтеза простагландинов и сигнальных каскадах, запускаемых эстрогенами.

Продукция IL-5 наблюдается преимущественно в тучных клетках при развитии аллергического ответа поздней фазы [22] и может вносить существенный вклад в развитие воспаления в тканях эктопического эндометрия. Повышение содержания IL-7 может стимулировать продукцию MIP-1β (воспалительный белок макрофагов), который является воспалительным хемокином. Повышенная экспрессия IL-7 выявлена в воспаленных тканях при аутоиммунных заболеваниях [23]. Помимо IL-7, IL-2 и IL-10 также ассоциированы с аутоиммунными состояниями, что свидетельствует о наличии аутоиммунного компонента в комплексном иммуномодулирующем эффекте различных цитокинов. Имеются данные, указывающие на наличие изменений в активности В-клеток и увеличение количества аутоантител у женщин с эндометриозом. Среди них различают антитела к фосфолипидам, гистонам, полинуклеотидам, а также антитела, специфические к тканям эндометрия и яичников [24]. tаким образом, дисрегуляция иммунных ответов в тканях эктопического эндометрия может приводить к повышению активности макрофагов, усилению пролиферативного ответа со стороны лейкоцитов и клеток эндометрия и образованию аутоантител. Лейкоциты и другие клетки выделяют цитокины и факторы роста во внеклеточное пространство эндометрия, где они могут функционировать как паракринные медиаторы, влияющие на активность соседних тканей. Таким образом, воспалительный процесс и окислительный стресс могут вносить существенный вклад в совокупность патогенетических процессов, приводящих к нарушению функции яичников и снижению ОВР.

Установлено, что у больных эндометриозом в фолликулярной жидкости наблюдаются повышение содержания IL-1β, IL-6 и TNF-α и снижение уровня VEGF [25, 26]. Снижение уровня VEGF у женщин с эндометриозом может приводить к снижению качества эмбрионов и вероятности имплантации, в частности за счет нарушений ангиогенеза и трофики клеток яичника [27]. Повышение уровня цитокинов в свою очередь может вызывать нарушения клеточного цикла фолликулярных клеток и приводить к замедлению созревания ооцитов [28].

Повышение уровня IL-6 в преовуляторных фолликулах пациенток с эндометриозом приводит к снижению активности ароматазы через активацию сигнального пути MAPK. Снижение активности ароматазы приводит к снижению конверсии фолликулами андростендиона в эстрон и его преобразованию в тестостерон, который превращается в эстроген. Снижение продукции эстрогенов фолликулами лежит в основе снижения ОВР и бесплодия [29, 30]. Снижение содержания прогестерона в фолликулярной жидкости также показано у больных эндометриозом, что может быть подтверждением нарушений стероидогенеза в яичниках [27].

Продукция цитокинов и активация лейкоцитов на локальном уровне могут приводить к усилению продукции реактивных форм кислорода и развитию окислительного стресса. У больных эндометриозом обнаружено повышение уровня маркеров окисления ДНК и перекисного окисления липидов в клетках гранулезы, что может быть причиной нарушения их функций и приводить к замедлению роста фолликулов [28]. Показано также, что окислительный стресс индуцирует повреждение геномной и митохондриальной ДНК, что непосредственно приводит к снижению фертильности [31]. В ряде исследований [32] установлено, что инкубация гамет и эмбрионов в присутствии перитонеальной жидкости больных эндометриозом приводит к повышению дефрагментации ДНК, и степень повреждения коррелирует с длительностью экспозиции и тяжестью заболевания. Можно предположить, что увеличение повреждения ДНК ооцитов и эмбрионов приводит к увеличению числа самопроизвольных патологических прерываний беременности, неудачам при оплодотворении и имплантации у пациентов с эндометриозом.

Далее в процессе биоинформационной обработки данных выявлено 15 сигнальных путей, запускаемых активацией клеточных рецепторов. Наиболее представленными по количеству генов явились сигнальные пути, ассоциированные с ядерными рецепторами, к которым относятся рецепторы к половым гормонам. В частности, наблюдалось снижение экспрессии рецепторов к прогестерону, а также снижение экспрессии эстрогенового рецептора 1-го типа (ESR1) и повышение экспрессии эстрогенового рецептора 2-го типа (ESR2) в очагах эктопического эндометрия. С данным фактом связывают развитие резистентности к прогестерону и снижение его антипролиферативного эффекта. Изменение соотношения уровней экспрессии подтипов эстрогеновых рецепторов показано ранее, причем повышение экспрессии ESR2 ассоциировано со снижением метилирования промотора его гена [33]. Повышение экспрессии ESR2 приводит к подавлению экспрессии ESR1, а усиление сигнализации через ESR2 — к снижению экспрессии рецепторов к прогестерону [33, 34]. Данный механизм способствует развитию резистентности к прогестерону и снижению его антипролиферативного и проапоптотического влияния на клетки эктопического эндометрия, а также снижению экспрессии фермента метаболизма эстрогенов HSD17B2 [35, 36].

Помимо сигнальных путей ядерных рецепторов, выявлены сигнальные пути, активируемые рецепторами факторов роста (VEGF, TGF-β, Hedgehog, Notch) и некоторых гормонов (тиреотропин, глюкокортикоиды); эти сигнальные пути реализуются через сигнальные каскады, ключевыми регуляторами которых являются киназы PI3K, Akt, Ras, MAPK. Показано 4 сигнальных пути, включающие Wnt сигнальный каскад, играющий важную роль в процессах пролиферации и клеточной дифференцировки, который запускается Wnt-лигандами и их рецепторами (Frizzled-рецепторы, FZD). Сигнальные пути Wnt, Hedgehog, Notch являются ключевыми в регуляции активности стволовых клеток для осуществления процессов развития, обновления и регенерации тканей млекопитающих, в том числе и эндометрия. На основании результатов ряда исследований появилось предположение, что поддержание и развитие эндометриоидных гетеротопий происходит не только в результате изменения продукции половых гормонов и экспрессии их рецепторов, но и за счет дисбаланса в сигнализации указанных выше путей [37]. Обсуждается и гипотеза о том, что развитие и рецидив заболевания могут быть связаны с образованием стволовых клеток в тканях эндометрия, способных пережить длительное отсутствие эстрогеновой стимуляции на фоне медикаментозной терапии или при снижении функции яичников. Поддержание клона таких клеток и их последующая экспансия могут регулироваться при участии Wnt, Hedgehog и Notch сигнальных каскадов [37, 38].

Кроме этого, выявлен сигнальный путь, запускаемый серотониновыми рецепторами. Модулирование серотониновой сигнализации может быть связано со снижением порога болевой чувствительности и развитием болевого синдрома у больных эндометриозом.

Отдельно следует отметить обогащение по сигнальному пути развития бесплодия, связанного с нарушением овариальной функции. В данный сигнальный путь вошли 8 дифференциально экспрессированных генов: 5 генов с повышенной экспрессией и 3 — с пониженной экспрессией. В частности, наблюдаются снижение экспрессии генов прогестероновых и пролактиновых рецепторов и повышение экспрессии генов эстрогенового рецептора 2-го типа, рецептора фолликулостимулирующего гормона и рецептора PGE2. Помимо рецепторов, выявлены гены, входящие в пути биосинтеза простагландинов. Можно предположить, что PGE2 и другие эйкозаноиды, образующиеся в тканях эндометриоидной кисты, кроме участия в воспалительных реакциях, могут оказывать действие на соседние ткани яичника, влияя на активацию и атрезию фолликулов. Необходимо подчеркнуть, что дисрегуляция экспрессии мкРНК в эутопическом эндометрии и нарушения клеточной сигнализации указанных выше сигнальных путей также могут вносить существенный вклад в развитие бесплодия у больных эндометриозом за счет нарушения процессов децидуализации. Формирование адекватного интерфейса на внутренней поверхности матки, обеспечивающего прикрепление, инвазию, трофику и иммунорезистентность зародыша, необходимо для успешной имплантации и развития беременности. Поэтому аберрантная децидуализация является одним из ключевых факторов формирования бесплодия. Идентифицировано несколько клеточных путей, способных при эндометриозе вызывать дефекты децидуализации. Основным гормоном, инициирующим и поддерживающим децидуализацию, является прогестерон. Клеточные пути, реализуемые при участии протеинкиназы, А (РКА), усиливают эффекты прогестерона, тогда как активация сигнальных путей киназ АКТ и МАРК их ингибирует [39]. Активация сигнального пути киназы AKT может также приводить к снижению экспрессии рецепторов прогестерона, что показано на примере стромальных клеток эндометрия, полученных от больных эндометриозом [40, 41]. Кроме этого, ингибиторы киназы АКТ повышают экспрессию прогестероновых рецепторов, снижают выживаемость клеток за счет стимулирования апоптоза при эндометриозе [41]. NOTCH1 — еще один ген, который имеет решающее значение для децидуализации. Снижение сигнализации Notch связано с эндометриозом и способствует нарушению децидуализации за счет снижения экспрессии транскрипционного фактора FOXO1 [42]. Исследования также показали, что сигнальный путь киназы МАРК может быть гиперактивным в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом, поскольку выявлены существенные изменения экспрессии компонентов сигнальных каскадов киназ МАРК и PI3K [43, 44]. В нашем исследовании установлено, что транскрипты мРНК входят в состав киназных путей PI3K/Akt и MAPK, рецепторных каскадов Wnt, Notch, Hedghog, TGF-β и VEGF, путей биосинтеза простагландинов и молекул фокальной адгезии. Изменение активности данных сигнальных путей может приводить к нарушению процессов децидуализации и имплантации.

Показано также, что ряд указанных генов являются регуляторными мишенями дэ-мкРНК. В частности, валидированными мишенями, обнаруженными в ходе исследования дэ-мкРНК, являются гены, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировки, среди которых можно выделить рецепторы (FZD7, KIT, NTRK2, ESR1), киназы (AKT3, PIM1, TP53, PIM1, PLK1), регуляторы клеточного цикла (CDC25, CCNE2) и транскрипционные факторы (GATA4, FOXC1, LEF1, FOXM1, MYB). Важной группой мишеней являются молекулы клеточной адгезии: интегрины (ITGA11, ITGA6), кадерины (CDH1), ламинины (LFVC2), которые могут участвовать в процессах адгезии, инвазии, миграции и эпителиально-мезенхимального перехода.

Заключение

Таким образом, биоинформационный анализ сигнальных путей и процессов, основанный на транскриптомных данных, показал, что идентифицированные гены могут принимать участие практически во всех аспектах патогенеза эндометриоза. Полученные результаты свидетельствуют о важном вкладе мкРНК в патогенез эндометриоза и сопутствующих ему осложнений, связанных с бесплодием. Следует отметить, что изменение содержания транскриптов мкРНК и мРНК не всегда сопровождается соответствующим изменением содержания целевого белка. При этом взаимодействие мкРНК с мРНК-мишенью может не приводить к деградации последней, поэтому анализ изменения транскриптома может дать только первичную информацию как о возможных мишенях мкРНК (мРНК и их белковых продуктах), так и о возможных изменениях активности путей внутриклеточной сигнализации, в состав которых они входят. Для большинства установленных в результате анализа экспрессируемых генов отсутствует информация о дифференциальной экспрессии кодируемых ими белков в тканях эктопического и эутопического эндометрия. В этой связи представляется целесообразным наряду с оценкой транскриптома (мкРНК и мРНК) проводить профилирование белкового состава исследуемых тканей для получения более полной информации о взаимосвязи между дэ-мкРНК и их белковыми мишенями. Тем не менее представленный подход представляется перспективным для обобщения многоуровневых молекулярных взаимодействий, а также для выявления компонентов сигнальных путей, участвующих в развитии эндометриоза. Дальнейшие исследования с использованием протеомных и биоинформационных технологий, направленные на определение белковых продуктов генов в клетках и тканях эктопического и эутопического эндометрия, позволят получить более полное представление о молекулярных механизмах патогенеза эндометриоза, а также выявить возможные терапевтические мишени для лечения этого заболевания.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований офи_м № 16−29−07390

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Е.С. Филиппова — аспирант отделения гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: lenfil83@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-3503-3246

Н.А. Межлумова — аспирант отделения гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России; Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-6113-944X

А.М. Гамисония — научный сотрудник лаборатории молекулярной патофизиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0001-8532-4714

Ч.М. Эльдаров — старший научный сотрудник лаборатории молекулярной патофизиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-4027-6469

М.В. Кузнецова — научный сотрудник института репродуктивной генетики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия

Д.Ю. Трофимов — д.м.н., директор института репродуктивной генетики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия

С.В. Павлович — к.м.н., ученый секретарь ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия

И.Ф. Козаченко — к.м.н., старший научный сотрудник отделения гинекологии, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-1822-9164

М.Ю. Бобров — к.х.н., зав. лабораторией молекулярной патофизиологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия. https://orcid.org/0000-0002-5837-473X

Л.В. Адамян — д.м.н., проф., акад. РАН, зав. отделением гинекологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия

Corresponding author: E.S. Filippova —National Medical Reseach Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov; e-mail: lenfil83@yandex.ru

Список литературы:

  1. Tosti C, Pinzauti S, Santulli P, Chapron C, Petraglia F. Pathogenetic Mechanisms of Deep Infiltrating Endometriosis. Reproductive Sciences. 2015;22(9):1053-1059. https://doi.org/10.1177/1933719115592713
  2. Alborzi S, Keramati P, Younesi M, Samsami A, Dadras N. The impact of laparoscopic cystectomy on ovarian reserve in patients with unilateral and bilateral endometriomas. Fertility and Sterility. 2014;101(2):427-434. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.10.019
  3. Адамян Л.В., Гаспарян С.А. Генитальный эндометриоз. Современный взгляд на проблему: Монография. Ставрополь: Издательство: Ставропольская государственная медицинская академия, 2004.
  4. Guo H, Ingolia NT, Weissman JS, Bartel DP. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 2010;466(7308):835-840. https://doi.org/10.1038/nature09267
  5. Fabian MR, Sonenberg N, Filipowicz W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annual Review of Biochemistry. 2010;79(1):351-379. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060308-103103
  6. Kloosterman WP, Plasterk RHA. The Diverse Functions of MicroRNAs in Animal Development and Disease. Developmental Cell. 2006;11(4):441-450. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2006.09.009
  7. Ng YH, Rome S, Jalabert A, Forterre A, Singh H, Hincks CL, Salamonsen LA. Endometrial exosomes/ microvesicles in the uterine microenvironment: A new paradigm for embryo-endometrial cross talk at implantation. PLoS One. 2013;8(3):58502. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058502
  8. Pan Q, Luo X, Toloubeydokhti T, Chegini N. The expression profile of micro-RNA in endometrium and endometriosis and the influence of ovarian steroids on their expression. Molecular Human Reproduction. 2007;13:797-806. https://doi.org/10.1093/molehr/gam063
  9. Kuokkanen S, Chen B, Ojalvo L, Benard L, Santoro N, Pollard JW. Genomic profiling of microRNAs and messenger RNAs reveals hormonal regulation in microRNA expression in human endometrium. Biology of Reproduction. 2010;82:791-801. https://doi.org/10.1095/biolreprod.109.081059
  10. Braicu C, Tomuleasa C, Monroig P, Cucuianu A, Berindan-Neagoe I, Calin GA. Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology? Cell Death and Differentiation. 2015;22(1):34-45. https://doi.org/10.1038/cdd.2014.130
  11. Braza-Boïls A, Salloum-Asfar S, Marí-Alexandre J, Arroyo AB, González-Conejero R, Barceló-Molina M, García-Oms J, Vicente V, Estellés A, Gilabert-Estellés J, Martínez C. Peritoneal fluid modifies the microRNA expression profile in endometrial and endometriotic cells from women with endometriosis. Human Reproduction. 2015;30(10):2292-2302. https://doi.org/10.1093/humrep/dev204
  12. Yang X, Zhou Y, Peng S, Wu L, Lin HY, Wang S, Wang H. Differentially expressed plasma microRNAs in premature ovarian failure patients and the potential regulatory function of mir-23a in granulosa cell apoptosis. Reproduction. 2012;144:235-244. https://doi.org/10.1530/rep-11-0371
  13. Kim YJ, Ku SY, Kim YY, Liu HC, Chi SW, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY. MicroRNAs transfected into granulosa cells may regulate oocyte meiotic competence during in vitro maturation of mouse follicles. Human Reproduction. 2013;28:3050-3061. https://doi.org/10.1093/humrep/det338
  14. Monsanto SP, Edwards AK, Zhou J, Nagarkatti P, Nagarkatti M, Young SL, Lessey BA, Tayade C. Surgical removal of endometriotic lesions alters local and systemic proinflammatory cytokines in endometriosis patients. Fertility and Sterility. 2016;105(4):968-977. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.11.047
  15. Lawson C, Al-Akoum M, Maheux R, Akoum A. Increased expression of interleukin-1 receptor type 1 in active endometriotic lesions. Reproduction. 2007;133(1):265-274. https://doi.org/10.1530/rep.1.01121
  16. Tosato G, Jones KD. Interleukin-1 induces interleukin-6 production in peripheral blood monocytes. Blood. 1990;75(6):1305-1310.
  17. Akoum A, Lawson C, McColl S, Villeneuve M. Ectopic endometrial cells express high concentrations of interleukin (IL)-8 in vivo regardless of the menstrual cycle phase and respond to oestradiol by up-regulating IL-1-induced IL-8 expression in vitro. Molecular Human Reproduction. 2001;7(9):859-866. https://doi.org/10.1093/molehr/7.9.859
  18. Lebovic DI, Bentzien F, Chao VA, Garrett EN, Meng YG, Taylor RN. Induction of an angiogenic phenotype in endometriotic stromal cell cultures by interleukin-1β. Molecular Human Reproduction. 2000;6:269-275. https://doi.org/10.1093/molehr/6.3.269
  19. Chishima F, Hayakawa S, Sugita K, Kinukawa N, Aleemuzzaman S, Nemoto N, Yamamoto T, Honda M. Increased expression of cyclooxygenase-2 in local lesions of endometriosis patients. American Journal of Reproductive Immunology. 2002;48(1):50-56. https://doi.org/10.1034/j.1600-0897.2002.01101.x
  20. Ota H, Igarashi S, Sasaki M, Tanaka T. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Human Reproduction. 2001;16(3):561-566. https://doi.org/10.1093/humrep/16.3.561
  21. Wu MH, Lu CW, Chuang PC, Tsai SJ. Prostaglandin E2: the master of endometriosis? Experimental Biology and Medicine. 2010;235(6):668-677. https://doi.org/10.1258/ebm.2010.009321
  22. Kouro T, Takatsu K. IL-5 and eosinophil-mediated inflammation: from discovery to therapy. International Immunology. 2009;21(12):1303-1309. https://doi.org/10.1093/intimm/dxp102
  23. Yang Y, Xiao X, Li F, Du L, Kijlstra A, Yang P. Increased IL-7 expression in Vogt-Koyanagi-Harada disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2012;53(2):1012-1017. https://doi.org/10.1167/iovs.11-8505
  24. Eisenberg VH, Zolti M, Soriano D. Is there an association between autoimmunity and endometriosis? Autoimmunity Reviews. 2012;11(11):806-814. https://doi.org/10.1016/j.autrev.2012.01.005
  25. Pellicer A, Albert C, Mercader A, Bonilla-Musoles F, Remohi J, Simon C. The follicular and endocrine environment in women with endometriosis: local and systemic cytokine production. Fertility and Sterility. 1998;70:425-431. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(98)00204-0
  26. Garrido N, Navarro J, Remohi J, Simon C, Pellicer A. Follicular hormonal environment and embryo quality in women with endometriosis. Human Reproduction Update. 2000;6:67-74. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(98)00204-0
  27. Pellicer A, Albert C, Garrido N, Navarro J, Remohi J, Simon C. The pathophysiology of endometriosis-associated infertility: follicular environment and embryo quality. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 2000;55:109-119. https://doi.org/10.1023/a:1020363312252
  28. Saito H, Seino T, Kaneko T, Nakahara K, Toya M, Kurachi H. Endometriosis and oocyte quality. Gynecologic and Obstetric Investigation. 2002;53(Suppl 1):46-51. https://doi.org/10.1159/000049424
  29. Yoshida S, Harada T, Iwabe T, Taniguchi F, Mitsunari M, Yamauchi N, Deura I, Horie S, Terakawa N. A combination of interleukin-6 and its soluble receptor impairs sperm motility: implications in infertility associated with endometriosis. Human Reproduction. 2004;19(8):1821-1825. https://doi.org/10.1093/humrep/deh324
  30. Ulukus M, Cakmak H, Arici A. The role of endometrium in endometriosis. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 2006;13:467-476. https://doi.org/10.1016/j.jsgi.2006.07.005
  31. Guerin P, El Mouatassim S, Menezo Y. Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Human Reproduction Update. 2001;7:175-189. https://doi.org/10.1093/humupd/7.2.175
  32. Mansour G1, Abdelrazik H, Sharma RK, Radwan E, Falcone T, Agarwal A. L-carnitine supplementation reduces oocyte cytoskeleton damage and embryo apoptosis induced by incubation in peritoneal fluid from patients with endometriosis. Fertility and Sterility. 2009;91(5 Suppl):2079-2086. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.02.097
  33. Han SJ, O’Malley BW. The dynamics of nuclear receptors and nuclear receptor coregulators in the pathogenesis of endometriosis. Human Reproduction Update. 2014;20(4):467-484. https://doi.org/10.1093/humupd/dmu002
  34. Bulun SE, Cheng YH, Pavone ME, Xue Q, Attar E, Trukhacheva E, Tokunaga H, Utsunomiya H, Yin P, Luo X, Lin Z, Imir G, Thung S, Su EJ, Kim JJ. Estrogen receptor-beta, estrogen receptor-alpha, and progesterone resistance in endometriosis. Seminars in Reproductive Medicine. 2010;28(1):36-43. https://doi.org/10.1055/s-0029-1242991
  35. Bulun SE, Cheng YH, Yin P, Imir G, Utsunomiya H, Attar E, Innes J, Julie Kim J. Progesterone resistance in endometriosis: link to failure to metabolize estradiol. Molecular and Cellular Endocrinology. 2006;248(1-2):94-103. https://doi.org/10.1055/s-0029-1242991
  36. Reis FM, Petraglia F, Taylor RN. Endometriosis: hormone regulation and clinical consequences of chemotaxis and apoptosis. Human Reproduction Update. 2013;19(4):406-418. https://doi.org/10.1093/humupd/dmt010
  37. Susheelamma CJ, Pillai SM, Asha Nair S. Oestrogen, progesterone and stem cells: the discordant trio in endometriosis? Expert Reviews in Molecular Medicine. 2018;20:e2. https://doi.org/10.1017/erm.2017.13
  38. Barragan F, Irwin JC, Balayan S, Erikson DW, Chen JC, Houshdaran S, Piltonen TT, Spitzer TL, George A, Rabban JT, Nezhat C, Giudice LC. Human endometrial fibroblasts derived from mesenchymal progenitors inherit progesterone resistance and acquire an inflammatory phenotype in the endometrial niche in endometriosis. Biology of Reproduction. 2016;94(5):118. https://doi.org/10.1095/biolreprod.115.136010
  39. Lessey BA, Kim JJ. Endometrial receptivity in the eutopic endometrium of women with endometriosis: it is affected, and let me show you why. Fertility and Sterility. 2017;108(1):19-27. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.05.031
  40. Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ. Inhibition of AKT with the orally active allosteric AKT inhibitor, MK-2206, sensitizes endometrial cancer cells to progestin. PLoS One. 2012; 7:e41593. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041593
  41. Eaton JL, Unno K, Caraveo M, Lu Z, Kim JJ. Increased AKT or MEK1/2 activity influences progesterone receptor levels and localization in endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2013;98:E1871-1879. https://doi.org/10.1210/jc.2013-1661
  42. Su RW, Strug MR, Joshi NR, Jeong JW, Miele L, Lessey BA, Young SL, Fazleabas AT. Decreased Notch pathway signaling in the endometrium of women with endometriosis impairs decidualization. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2015; 100(3):E433-E442. https://doi.org/10.1210/jc.2014-3720
  43. Velarde MC, Aghajanova L, Nezhat CR, Giudice LC. Increased mitogenactivated protein kinase kinase/extracellularly regulated kinase activity in human endometrial stromal fibroblasts of women with endometriosis reduces 30,50-cyclic adenosine 50-monophosphate inhibition of cyclin D1. Endocrinology. 2009;150:4701-4712. https://doi.org/10.1210/en.2009-0389
  44. Matsuzaki S, Canis M, Pouly JL, Botchorishvili R, Dechelotte PJ, Mage G. Differential expression of genes in eutopic and ectopic endometrium from patients with ovarian endometriosis. Fertility and Sterility. 2006;86:548-553. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2006.02.093