Поиск механизмов, приводящих к ранним репродуктивным потерям при переносе эмбрионов хорошего качества, является актуальным направлением в лечении бесплодия путем применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Основной причиной неудач имплантации и остановки развития морфологически нормальных эмбрионов являются количественные хромосомные аномалии — анеуплоидии [1, 2]. Установлено, что около 25% ооцитов, полученных от женщин в возрасте 30 лет, содержат хромосомные аномалии, при этом частота анеуплоидии в ооцитах напрямую зависит от возраста и может достигать 80% у женщин старше 40 лет [3]. Таким образом, необходимость отбора эмбрионов с нормальным набором хромосом способствовала развитию нового диагностического направления — преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Селекция эмбрионов с использованием ПГТ позволяет повысить результативность ВРТ за счет увеличения частоты имплантации и снижения частоты потери беременности. С развитием молекулярно-генетических технологий совершенствуются методы, применяемые для ПГТ.

В качестве альтернативной методики забора материала для ПГТ исследователи предложили биопсию клеток трофэктодермы [4, 5]. Данный метод позволяет взять несколько клеток для анализа, что делает скрининг более надежным, сохраняя при этом целостность внутриклеточной массы [6, 7]. В настоящее время для скрининга анеуплоидий используются новые технологии, которые позволяют полностью проанализировать хромосомный набор эмбриона. Разработано несколько методик для анализа 24 хромосом, в том числе сравнительная геномная гибридизация на «биологических чипах» — micriarray comparative genomic hybridization (array-CGH) [8].

Криоконсервация эмбрионов — важный этап ВРТ, который способствует снижению частоты таких осложнений экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), как синдром гиперстимуляции яичников за счет отмены переноса в лечебном цикле и многоплодной беременности за счет возможности проведения преимплантационного генетического скрининга с последующим селективным переносом одного диагностированного эмбриона. Это позволяет увеличить кумулятивную частоту наступления беременности. Однако данных об успешных результатах проведения ПГТ на размороженных и ранее генетически не диагностированных эмбрионах немного.

В клиническом случае представлен процесс размораживания ранее криоконсервированных эмбрионов, последующего проведения в течение 24 ч преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидии (ПГТ-А) с использованием метода array-CGH и переноса в полость матки одного генетически нормального эмбриона.

Описание клинического случая

Пациентка Р., 1972 года рождения, в 2016 г. обратилась в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России с жалобами на отсутствие беременности в течение 8 лет регулярной половой жизни. Из анамнеза: менструации с 14 лет, умеренные, безболезненные, цикл регулярный по 4—5 дней через 28—29 дней. Половая жизнь с 18 лет, брак второй. В 2001 г. у пациентки при проведении лапароскопии установлены хронический сальпингоофорит, наружный генитальный эндометриоз; произведены сальпингоовариолизис, коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза.

С 2009 г. пациентка наблюдалась в одной из частных клиник Москвы, проведено 3 попытки ЭКО в протоколе с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), без эффекта. В июле 2012 г. в результате четвертой программы ЭКО и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) наступила беременность, замершая на сроке 9—10 нед. С 2013 г. наблюдалась в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ «НМИЦ АГП» Минздрава Р.Ф., в этом же году проведена 5-я программа ЭКО/ИКСИ, перенесено 2 эмбриона, без эффекта, произведена криоконсервация 2 эмбрионов.

В 2014 г. в результате 6-й программы ЭКО/ИКСИ с последующим переносом одного генетически здорового эмбриона в криопротоколе произошли оперативные роды на 38-й неделе гестации; родился здоровый доношенный мальчик.

Супруг 1973 года рождения, соматически здоров, по данным спермограммы — астенозооспермия (концентрация сперматозоидов — 32 млн/ мл; прогрессивно подвижных — 17%; морфологически нормальных сперматозоидов — 4%).

Пациентка в мае 2016 г. обратилась для планирования беременности с использованием полученных ранее эмбрионов. Учитывая возраст пациентки и данные анамнеза, для достижения беременности рекомендовано проведение размораживания криоконсервированных ранее эмбрионов с последующим генетическим тестированием на анеуплоидии.

Оплодотворение и культивирование эмбрионов

При трансвагинальной пункции яичников в 2012 г. аспирировано 6 ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) на стадии метафаза 2. Образец эякулята обрабатывали путем центрифугирования с использованием градиентов плотности SupraSperm («Origio», Дания). Эмбриологический этап проводили при пониженном содержании кислорода (мультигазовая смесь: 6% углекислого газа (CO₂), 5% кислорода (O₂); 89% азота (N₂) в инкубаторах типа Planer («Origio», Дания).

После получения ОКК культивировали в течение 2 ч в культуральной среде Universal IVF («Origio», Дания) при 37 °C в СО₂-инкубаторе («Origio», Дания). Через 2 ч ОКК обработали ферментом Hyadase («Origio», Дания) с последующим механическим пипетированием при последовательном использовании пипеток размером 170 и 140 мкм («COOK», Австралия) с целью очищения от клеток кумулюса. Метод оплодотворения (ИКСИ в ооцит) проводили в каплях 10 мкл среды Flushing Medium («Origio», Дания), покрытых Mineral Oil («Origio», Дания).

Оценку оплодотворения проводили через 16—18 ч после ИКСИ с использованием инвертированного микроскопа Nikon Ti-U при увеличении 40× («Nikon», Япония). Зиготы, имеющие 2 пронуклеуса, считали нормально оплодотворенными. Последующая оценка качества эмбрионов проводилась на 2, 3 и 5-е сутки культивирования. Эмбрион считался отличного качества, если на 2-е сутки культивирования у него при оценке визуализировались 4 равных бластомера без фрагментации и многоядерности; на 3-е сутки культивирования при оценке визуализировалось 8 равных бластомеров без фрагментации и многоядерности. На 5-е сутки культивирования эмбрионы оценивали по предложенной группой эмбриологов европейской ассоциацией репродукции и эмбриологии человека (ESHRE) системе оценки бластоцист [9].

Криоконсервация и размораживание эмбрионов

Криоконсервация эмбрионов выполнена методом витрификации. Витрификацию и размораживание эмбрионов проводили с использованием наборов Kitazato («Kitazato Corporation», Япония), согласно рекомендациям производителя [10]. После размораживания эмбрионы отмывали 3—4 раза в культуральной среде Blastocyst Medium (COOK, Австралия) и переносили в капли 50 мкл под слоем минерального масла для дальнейшего культивирования.

Проведение биопсии клеток трофэктодермы

Для биопсии клеток трофэктодермы использовали комбинацию осторожного всасывания пипеткой для аспирации клеток трофэктодермы (TPC, Австралия) и минимального количества лазерных импульсов (3,7 Вт/см² интенсивности) [4, 5]. Для проведения тестирования взято 5—7 клеток трофэктодермы.

Подготовка и проведение генетического тестирования на анеуплоидии

Биопсированный материал двукратно отмыли от культуральной среды и минерального масла и поместили в пробирки типа Эппендорф 0,2 мл без РНКазы и ДНКазы с общим объемом буфера 0,2 мкл при помощи пипетки 140 мкм (COOK, Австралия) с последующей немедленной передачей для проведения генетического анализа.

Сравнительную геномную гибридизацию генетического материала эмбриона Array-CGH проводили на оборудовании фирмы «Agilent» (США). Полногеномную амплификацию клеточной ДНК методом WGA-PCR (Whole Genome Amplification-Polymerase Chain Reaction) выполняли с помощью набора PicoPlex SingleCell WGA Kit («Rubicon Genomics», США). Качество и количество полученной ДНК контролировали с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле. Ампликоны метили с использованием набора SureTag DNA Labeling Kit («Agilent», США), согласно инструкции к набору. Меченые ампликоны наносили на биочип Sure Print G3 8×60 array-CGH («Agilent», США), гибридизировали в течение 16 ч, после чего отмывали и сканировали на сканере биологических чипов SureScan Microarray Scanner (США). Интерпретацию результатов проводили с помощью программного продукта Agilent CytoGenomics (США).

Культивирование эмбрионов после биопсии клеток трофэктодермы и перенос эмбрионов

После проведения биопсии эмбрионы культивировали в течение 24 ч в среде Blastocyst (COOK, Австралия) в каплях 50 мкл под слоем минерального масла («Origio», Дания) при пониженном содержании кислорода (мультигазовая смесь: 6% CO₂, 5% O₂; 89% N₂) в инкубаторах типа Planer («Origio», Дания).

Перенос выполнили через 24 ч после получения результатов генетического тестирования. На момент переноса эуплоидная бластоциста полностью вышла из оболочки (zona pellucida) и по классификации, предложенной группой эмбриологов ESHRE, оценена как 6BB [10]. Еще одна бластоциста, согласно проведенному генетическому тестированию, имела комплекс хромосомных отклонений и поэтому утилизирована. Для переноса использовали катетер COOK JETS 1719 (COOK, Австралия).

Поддержка посттрансферного периода и результат лечения

Перенос размороженных эмбрионов произведен на фоне десенситизации гипоталамо-гипофизарно-яичниковой (ГГЯ) системы агонистами ГнРГ с последующим проведением заместительной гормональной терапии (эстрадиола валерат в дозе 6 мг/сут) со дня подавления ГГЯ системы по результатам ультразвукового исследования (УЗИ) и исследования гормонального фона; при достижении эндометрием 9 мм и четкой трехслойной структуры вводили микронизированный прогестерон в дозе 600 мг/сут. Перенос размороженного эмбриона в полость матки осуществляли в асептических условиях под контролем с применением УЗИ на 6-й день приема микронизированного прогестерона; толщина эндометрия в день переноса составила 9 мм.

В результате переноса размороженного эмбриона наступила беременность, завершившаяся своевременными оперативными родами, родился здоровый доношенный мальчик (масса тела 3088 г, рост 50 см).