Гестационный сахарный диабет (ГСД) — это заболевание, характеризующееся гипергликемией, впервые выявленной во время беременности, но не соответствующее критериям «манифестного» сахарного диабета [1, 2]. В настоящее время ГСД считается многофакторным заболеванием, на развитие которого оказывают влияние многочисленные генетические факторы при взаимодействии с повреждающими экзогенными и эндогенными факторами. В публикациях последних десятилетий появилось много данных об общности генных сетей и молекулярных механизмов, провоцирующих развитие ГСД и других типов диабета [3]. Генетическая предрасположенность к ГСД рассматривается как комбинация функционально неблагоприятных аллелей самых разных групп генов, для многих из которых установлен полиморфизм. В исследованиях последних лет указывается на взаимосвязь с ГСД таких генов, как 1А HNF1A, GCK, KCNJ11, TCF7L2, ген реназы, KCNJ11, ABCC8, TCF7L2, ND1, INS, INSR, IGF2, IRS1, PPARG, PPARGC1A, ADRB3, GLUT1, ADIPOQ, FOXC2, PAI-1, MTRN1B [4—9].

Взаимодействие неблагоприятных и еще до конца не идентифицированных генетических детерминант с провоцирующими факторами внешней среды создает условие для высокой вероятности развития данной патологии. Принимая во внимание патогенетическое сходство ГСД и сахарного диабета (СД) 2-го типа, представляется актуальным исследование ассоциаций с ГСД генов-кандидатов СД 2-го типа [3]. При ГСД, который является многофакторным заболеванием, отдельный генетический вариант может иметь слабый индивидуальный эффект в отношении фенотипа, однако в сочетании с другими вариантами этот эффект может значительно усиливаться. Анализ аллельных вариантов генов (KCNJ11 K23E C>T, PPARG P12A C>G, TCF7L2 IVS3 C>T, TCF7L2IVS4 G>T) в сочетании с клиническими данными и взаимодействием ген—ген может рассматриваться как перспективный подход к выявлению пациентов с высоким риском развития ГСД.

Цель исследования — провести анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к ГСД.

В исследовании участвовали 122 беременных со спонтанно наступившей одноплодной беременностью и сроком гестации 8—36 нед. Основная группа (n=87) включала женщин с одноплодной беременностью, сроком гестации 8—36 нед и установленным диагнозом ГСД; средний возраст 33,69±5,55 года, средний индекс массы тела (ИМТ) 26,34±4,82 кг/м². Контрольную группу (n=35) составили соматически здоровые пациентки с физиологически протекающей одноплодной беременностью, средний возраст 28,49± 6,24 года, ИМТ 22,07±4,13 кг/м².

Критерии исключения: декомпенсированная экстрагенитальная патология, сахарный диабет 1-го и 2-го типов, многоплодная беременность.

Всем женщинам проводилось молекулярно-генетическое исследование методом пиросеквенирования с применением системы генетического анализа серии PyroMark Q24 («Qiagen N.V.», Нидерланды). ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови, используя комплект реагентов «ДНК-сорб-В» производства ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора. Далее проводили реакцию амплификации с помощью комплекта праймеров АмплиСенс Пироскрин производства ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора с последующей инкубацией ампликонов с частицами сефарозы, покрытыми стрептовидином. С использованием полуавтоматической вакуумно-фильтрационной станции (Vacuum Prep Workstation) осуществлялись щелочная денатурация ампликонов и серия отмывок с образованием одноцепочечного ПЦР-продукта, используемого как матрица для пиросеквенирующего синтеза. Впоследствии выполнялись реакция пиросеквенирования и анализ полученных результатов. Детекция реакции пиросеквенирующего синтеза осуществлялась автоматически в режиме реального времени с помощью пиросеквенатора серии PyroMark Q24. В работе изучено 4 полиморфных варианта локусов в генах KCNJ 11, PPARG, TCF7L2 (табл. 1).

Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Различия между непараметрическими переменными обнаруживали при помощи критерия χ² Пирсона. Относительный риск оценивали по показателю соотношения шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05. Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди—Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy—Weinberg equilibrium.

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом участвующего клинического центра. До включения в исследование у всех участников получено информированное согласие.

С целью выявления генетической предрасположенности к развитию ГСД проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов по полиморфным вариантам генов KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), TCF7L2 (IVS4 G>T) у женщин основной и контрольной групп. Распределение частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов генов у женщин основной и контрольной групп соответствовало равновесию Харди—Вайнберга.

Для выявления ассоциации вариантных аллелей и генотипов по исследуемым локусам генов инсулинорезистентности использовались общая и мультипликативная модели.

Анализ распределения генотипов по полиморфным локусам исследованных генов показал роль полиморфных маркеров KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G) и TCF7L2 (IVS4 G>T) в риске формирования ГСД, так как у женщин основной группы статистически значимо чаще встречались гомозиготы KCNJ11 CC по полиморфному маркеру KCNJ11 (K23E C>T) (χ²=14,01; ОШ=4,52; 95% ДИ 1,92—10,61; р<0,0009); гомозиготы PPARG СС по полиморфному маркеру PPARG (P12A C>G) (χ²=10,68; ОШ=4,34; 95% ДИ 1,72—10,94; р<0,005), гомозиготы TCF7L2 (IVS4) GG по полиморфному маркеру TCF7L2 (IVS4 G>T) (χ²=13,5; ОШ=4,69; 95% ДИ 1,87—11,81; р<0,001) (табл. 2).

Статистически значимых различий у женщин основной и контрольной групп в частоте встречаемости генотипов по полиморфизму TCF7L2 (IVS3 C>T) не было (см. табл. 2).

Анализ распределения аллелей исследуемых генов показал более высокую частоту выявления вариантного аллеля С полиморфного ДНК-локуса KCNJ11 (K23E C>T) у женщин основной группы (χ²=8,66; ОШ =2,59; 95% ДИ 1,36—4,94; р<0,05) (табл. 3).

Аналогичная тенденция выявлена и для полиморфизма P12A C>G гена PPARG: частота вариантного аллеля С гена PPARG была выше у женщин основной группы по сравнению с женщинами контрольной группы (χ²=10,29; ОШ=3,21; 95% ДИ 1,53—6,7; р<0,05) (см. табл. 3).

Кроме того, у женщин с беременностью, осложненной ГСД, с высокой степенью статистической значимости чаще встречались патологические аллели G гена TCF7L2 (IVS4 G>T), чем у женщин контрольной группы (χ²=9,51; ОШ=2,88; 95% ДИ 1,14—5,75; р<0,05) (см. табл. 3).

Других статистически значимых различий в частоте распределения аллелей по полиморфным локусам исследуемых генов не было.

Результаты молекулярно-генетического тестирования полиморфизма генов KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), TCF7L2 (IVS4 G>T) у женщин основной и контрольной групп позволили выявить ассоциации исследованных генотипов KCNJ11 СС, PPARG СС и TCF7L2 (IVS4) GG с риском формирования ГСД у пациенток группы риска.

Согласно общепринятому мнению, в основе наследственной предрасположенности к многофакторной патологии, к которой относится и ГСД, лежит специфическая комбинация аллелей нескольких генов, оказывающих влияние на развитие заболевания или модифицирующих клинические проявления болезни.

В настоящее время большинство исследователей считают, что отдельные генетические варианты вносят достаточно низкий вклад в формирование патологического фенотипа, поэтому для понимания ключевых звеньев патогенеза заболевания следует анализировать межгенные и генно-средовые взаимодействия, играющие роль в формировании клинического фенотипа заболевания.

Известным подходом для моделирования межгенных взаимодействий является биоинформатический метод сокращения многофакторной размерности (MDR). В результате исследования установлено 7 генотипов повышенного риска и 15 генотипов пониженного риска развития ГСД (см. рисунок).

По данным многофакторного анализа сформирована трехлокусная модель, представлявшая собой совокупность из генотипов KCNJ11 CT, PPARG CG и TCF7L2 (IVS4) GT и характеризовавшаяся чувствительностью 86% и специфичностью 65% (табл. 4).

Выявлена роль полиморфизма генов KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G) и TCF7L2 (IVS4 G>T) в риске формирования ГСД.

Наличие в генотипе вариантного аллеля С по полиморфному варианту KCNJ11 увеличивает шансы развития ГСД у беременных (χ²=8,66; ОШ=2,59; 95% ДИ 1,36—4,94; р<0,003). При этом риск развития данной патологии возрастает только при наличии гомозиготного генотипа KCNJ11 CC по полиморфному маркеру KCNJ11 (K23E C>T) (χ²=14,01; ОШ=4,52; 95% ДИ 1,92—10,61; р<0,0009). Аллель KCNJ11 T этого локуса оказывает протективный эффект в отношении данной патологии (χ²=8,66; ОШ=0,39; 95% ДИ 0,2—0,74; р<0,003).

Известно, что продукты гена KCNJ11 — это белки, участвующие в формировании АТФ-зависимых калиевых каналов. В β-клетках поджелудочной железы АТФ-зависимые калиевые каналы играют ключевую роль в регуляции секреции инсулина, индуцированной глюкозой, и являются мишенью для сульфонилмочевины (пероральное гипогликемическое средство, широко используемое в лечении СД 2-го типа). Закрытие каналов и ингибирование их открытия инициирует секрецию инсулина. При изменениях в этом гене (аллель 23К в гене KCNJ11) калиевые каналы остаются открытыми, несмотря на поступление глюкозы, вследствие чего не происходит достаточной стимуляции выхода инсулина в кровоток в ответ на гипергликемию [10].

Частота выявления аллеля С гена KCNJ11 в европейской популяции составляет около 66%, аллеля Т — примерно 34%. Анализ результатов генотипирования женщин основной и контрольной групп по полиморфизму PPARG (P12A C>G) показал, что наличие в генотипе вариантного аллеля С увеличивает шансы развития ГСД у беременных (χ²=10,29; ОШ=3,21; 95% ДИ 1,53—6,7; р<0,001). Как показало распределение объема генотипов по этому же локусу, риск развития ГСД возрастает только при наличии гомозиготного генотипа аллеля PPARG СC по полиморфному маркеру PPARG (P12A C>G) (χ²=10,68; ОШ=4,34; 95% ДИ 1,72—10,94; р<0,005). Аллель PPARG G, наоборот, обладает протективным эффектом в отношении данной патологии (χ²=10,29; ОШ=0,31; 95% ДИ 0,15—0,65; р<0,001).

Активаторы пролиферации пероксисом, такие как PPARG, связывают химические вещества, которые вызывают увеличение числа органелл, способствующих окислению жирных кислот. PPARG преимущественно экспрессируется в жировой ткани и участвует в дифференциации адипоцитов, а также определяет потребность мышечной ткани в глюкозе и ее чувствительность к инсулину. Умеренное ослабление функций этого рецептора (вариант 12Ala гена PPARG) сопровождается снижением инсулиновой сопротивляемости и повышением секреции инсулина β-клетками, что ведет к снижению риска развития СД 2-го типа, гиперинсулинемии, инсулинорезистентности и атеросклероза [11].

Частота выявления генотипа СC в европейской популяции составляет 84,5%, генотипа СG — 14,9%, генотипа GG — 0,6%.

Исследования показали значение полиморфного локуса TCF7L2 (IVS4 G>T) в наследственной предрасположенности к ГСД, так как наличие в генотипе вариантного аллеля G по полиморфному варианту TCF7L2 увеличивает шансы развития ГСД у беременных (χ²=9,51; ОШ=2,88; 95% ДИ 1,44—5,75; р<0,002). Аллель TCF7L2T, вероятно, оказывает протективный эффект в отношении данной патологии (χ²=9,51; ОШ=0,35; 95% ДИ 0,17—0,69; р<0,002).

Распределение объема генотипов по этому же локусу показало, что риск развития ГСД возрастает только при наличии гомозиготного генотипа аллеля TCF7L2 (IVS4) GG по полиморфному маркеру TCF7L2 (IVS4 G>T) (χ²=13,5; ОШ=4,69; 95% ДИ 1,87—11,81; р<0,001).

Ген TCF7L2 кодирует Т-клеточный транскрипционный фактор, участвующий в контроле гомеостаза глюкозы. При взаимодействии с белками сигнального пути Wnt продукт гена регулирует секрецию проглюкагона в энтероэндокринных клетках, что в свою очередь определяет индуцированную глюкозой секрецию инсулина и регулирует созревание β-клеток поджелудочной железы из полипотентных стволовых клеток. Таким образом, повышение выработки продукта гена (Т-аллель гена TCF7L2) приводит к нарушению толерантности к глюкозе и снижению секреции инсулина [12].

Н.А. Зубкова и соавт. [7] изучили структуру неиммунных форм ГСД, включая редкие моногенные формы данной группы заболеваний. Исследователями выявлены мутации в одном из генов, ответственных за развитие диабета типа MODY. Гетерозиготные мутации в гене GCK (MODY2) превалируют в структуре моногенных форм ГСД. Выявлены также гетерозиготные миссенс-мутации в генах HNF4A, HNF1A, HNF1B, INSR, GLIS3, KCNJ11, PAX4 G PTF1A.

Для учета возможного влияния различных комбинаций изучаемых генов на риск развития ГСД использован биоинформатический метод MDR, позволивший выявить 7 генотипов повышенного риска развития ГСД и 15 генотипов пониженного риска формирования ГСД, а также разработать трехлокусную модель генетической предрасположенности к данной многофакторной патологии. Согласно этой модели, комбинация трех генотипов по трем полиморфным вариантам генов KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G) и TCF7L2 (IVS4 G>T) обусловливает повышенный риск развития ГСД.

Установлена ассоциация полиморфных маркеров KCNJ11 (K23E C>T), PPARG (P12A C>G), TCF7L2 (IVS3 C>T), TCF7L2 (IVS4 G>T) с риском формирования гестационного сахарного диабета: наличие в генотипе вариантных аллелей KCNJ11: C, PPARG: C и TCF7L2: G увеличивает шансы развития данной патологии у беременных. Анализ межгенных взаимодействий позволил определить генотипы повышенного и пониженного риска развития гестационного сахарного диабета и получить трехлокусную модель генетической предрасположенности к данной патологии. Комплексная оценка различных групп полиморфизмов, влияющих на различные пути патогенеза определенной многофакторной патологии, является более перспективной, чем однофакторный анализ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В., Е.Г., Т.Б.

Сбор и обработка материала — Т.Б., О.Б.

Статистический анализ данных — Н.В., Е.Г., Т.Б., О.Б.

Написание текста — Н.В., Е.Г., Т.Б., О.Б.

Редактирование — Н.В., Е.Г., Т.Б., О.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Башмакова Н.В. — д.м.н., проф., главный научный сотрудник ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» Минздрава России, Екатеринбург; https://orcid.org/0000-0002-9938-7684

Третьякова Т.Б. — к.м.н., ст.н.с., врач-генетик, заведующая медико-генетической лабораторией ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» Минздрава России, Екатеринбург; https://orcid.org/0000-0002-5715-7514; e-mail: tbtretyakova@yandex.ru

Фролухина О.Б. — врач акушер-гинеколог ФГБУ «Уральский НИИ ОММ», очный аспирант; https://orcid.org/0000-0002-0709-9467; e-mail: Lelik-eburg@yandex.ru

Дерябина Е.Г. — врач-эндокринолог, д.м.н., вед.н.с. ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» Минздрава России, Екатеринбург; https://orcid.org/57191620146; e-mail: helen_mic@mail.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Башмакова Н.В., Третьякова Т.Б., Фролухина О.Б., Дерябина Е.Г. Гестационный сахарный диабет — генетические аспекты. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-28. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Фролухина Ольга Борисовна — e-mail: Lelik-eburg@yandex.ru