Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) — процедура определения генетической и/или хромосомной патологии эмбриона до его переноса в полость матки. Применявшиеся ранее термины «преимплантационная генетическая диагностика/скрининг» (ПГД/ПГС) в настоящее время заменены на «преимплантационное генетическое тестирование». ПГТ предусматривает два этапа: биопсия эмбриона — изъятие одной или нескольких клеток для получения источника ДНК и последующий ее анализ молекулярно-генетическими методами. В настоящее время по мере расширения спектра выявляемых аномалий востребованность процедуры ПГТ непрерывно возрастает. Проведение ПГТ помогает родить здорового ребенка семейным парам — носителям наследственных заболеваний (ПГТ моногенных заболеваний, ПГТ-M), семьям с наследственными транслокациями и другими особенностями кариотипа (ПГТ структурных перестроек, ПГТ-СП). Проведение доимплантационной генетической диагностики широко применяется для скринингового исследования числа хромосом эмбрионов (ПГТ на анеуплоидии, ПГТ-А), которое дает возможность избежать рождения детей с хромосомными синдромами [1].

Важным условием выполнения ПГТ является минимальное повреждение эмбриона при изъятии материала для исследования, при этом необходимо получить достаточное для анализа количество ДНК. Главными принципами при биопсии эмбрионов должны быть минимизация вреда и сохранение их репродуктивного потенциала [2]. Процедура биопсии эмбриона человека может выполняться на разных стадиях развития эмбриона. В настоящее время наиболее широко применяемой является биопсия трофэктодермы.

В современной практике клинической эмбриологии идут поиск и апробация новых неинвазивных методов биопсии или иных методов получения ДНК эмбриона для исследований, таких как генетический анализ среды культивирования эмбрионов [3]. Первая преимплантационная генетическая диагностика проведена на эмбрионах кролика. Материал для диагностики получен методом биопсии эмбриона на стадии бластоцисты [4]. В 1989 г. опубликована работа об успешной биопсии эмбриона человека на стадии дробления с целью определения пола [5]. Первоначально преимплантационная диагностика применялась для выявления моногенных и сцепленных с полом генетических заболеваний. С целью выявления носительства моногенного заболевания также использовали анализ ДНК, полученной при биопсии полярных телец [6]. Цитогенетические методы исследования, а именно FISH (fluorescence in situ hybridization, флюоресцентная гибридизация in situ), позволили определять число хромосом в фиксированном бластомере [7]. По мере развития технологий и перехода от цитогенетических к молекулярно-генетическим методам стало возможным определение анеуплоидий по всем 22 парам аутосом и половым хромосомам. Это позволило говорить о преимплантационном генетическом скрининге [8]. Следует отметить, что развитие и применение методов биопсии нельзя рассматривать в отрыве от развития методов молекулярно-генетического анализа. В процессе их совершенствования ПГТ начали использовать для многих других целей, таких как диагностика предрасположенности к опухолевым заболеваниям [9], выявление митохондриальных нарушений [10], оценка вероятности резус-конфликта [11], оценка системы тканевой совместимости HLA [12].

Биопсия полярных телец — один из малоинвазивных методов биопсии: так как полярные тельца самопроизвольно отделяются от ооцита, их взятие не травмирует яйцеклетку. Исследование хромосомного и/или генетического статуса полярных телец — способ непрямой оценки хромосомного и/или генетического статуса ооцита. Метод не может давать полного представления о наличии или отсутствии патологии эмбриона, так как при его применении невозможно оценить генетическую составляющую, привнесенную сперматозоидом. Кроме того, очень высок уровень ошибок, ложноположительных и ложноотрицательных результатов [13]. Однако этот метод получил развитие в странах, в которых существуют законодательные ограничения на биопсию эмбрионов [14, 15]. Наибольшая информативность метода достигается при биопсии обоих полярных телец. В зависимости от способа анализа полярных телец возможна одновременная биопсия 1-го и 2-го полярных телец (последующий анализ методом FISH), или последовательная биопсия при замораживании яйцеклетки после биопсии 1-го полярного тельца, или при последующем анализе методами полимеразной цепной реакции (ПЦР), сравнительной геномной гибридизации (СGH), секвенирования нового поколения (NGS). Биопсию 2-го полярного тельца проводят через 8—14 ч после оплодотворения. В случае более ранней биопсии 2-го полярного тельца возможна энуклеация, так как все веретено деления может быть изъято вместе со 2-м полярным тельцем. Этот метод является наиболее экономически нецелесообразным, так как исследуются все ооциты, часть из которых затем не оплодотворяется, а часть отбраковывается ввиду низких морфологических характеристик и отставания в развитии. При этом нет свидетельств о негативном влиянии биопсии полярных телец на потенциал эмбриона к имплантации [2].

Широкое применение в рутинной практике получил метод биопсии бластомеров эмбриона на 3-и сутки развития. В этот момент в эмбрионе насчитывается 6—8 бластомеров. В ходе биопсии из объема эмбриона изымаются 1 или 2 клетки. Для облегчения изъятия клеток часто биопсию проводят в среде без кальция и магния, что ведет к потере адгезии между бластомерами и облегчает проведение манипуляции, снижает вероятность механического повреждения соседних бластомеров [16]. Рекомендовано проведение биопсии 3-суточного эмбриона в случае, если он имеет не менее 6 бластомеров, и фрагментация занимает менее 30% объема [2, 17]. В недавнем прошлом на долю биопсии на 3-и сутки развития приходилось 90% всех выполняемых биопсий эмбрионов [18]. Возможное негативное влияние биопсии бластомеров у 3-суточных эмбрионов широко обсуждалось, опубликовано множество работ как подтверждающих, так и опровергающих негативное влияние биопсии на потенциал к имплантации. В частности, показано, что эмбрионы после биопсии на стадии 6—8 бластомеров дробления образуют бластоцисты меньшего размера с утолщенной блестящей оболочкой (zona pellucida), что обусловлено нефизиологическим хетчингом эмбриона [19]. Окончательно то, что биопсия эмбрионов на 3-и сутки развития сильно влияет на жизнеспособность эмбриона и его потенциал к имплантации, подтвердили R. Scott и соавт. [20] в 2013 г. в результате двойного слепого рандомизированного исследования. Для переноса женщинам (моложе 35 лет с хорошим овариальным резервом) выбрали 2 эмбриона наилучшего качества во время стандартного цикла экстракорпорального оплодотворения, один эмбрион был подвергнут биопсии, другой же оставляли интактным, затем оба эмбриона переносили без анализа биоптата. Если имплантировался только один эмбрион, то ДНК плода сравнивали с ДНК из биоптата, чтобы оценить их соответствие. Это исследование показало, что существует значительное снижение (39%) потенциала к имплантации эмбриона после биопсии бластомера на 3-и сутки развития. Интересно отметить, что в ходе аналогичного исследования воздействия биопсии трофэктодермы, выполненной на стадии бластоцисты, авторы не отметили ее влияния на потенциал эмбрионов к имплантации.

Метод предложен российской группой исследователей [21]. Как и при биопсии эмбриона на 3-и сутки развития, манипуляции с эмбрионом проводятся в безкальциево-безмагниевой среде, которая обусловливает декомпактизацию эмбриона на стадии морулы, в это время эмбрион состоит из гораздо большего числа клеток (20—30), чем эмбрион 3-суточный. Это позволяет взять для исследования несколько клеток и уменьшить риск влияния эмбрионального мозаицизма на точность диагностики. Кроме того, при биопсии эмбрионов на 4-е сутки развития есть возможность провести диагностику эмбрионов на анеуплоидии (в данном исследовании использовали FISH) до 5—6-х суток культивирования эмбриона, что дает возможность сделать перенос в этом же цикле, а так же криоконсервировать только эмбрионы без хромосомной или генетической патологии. Авторами не выявлены статистически значимые различия в частоте наступления беременности между группами пациенток с биопсией и без нее. Таким образом, метод биопсии эмбриона на стадии морулы может рассматриваться как перспективный, требующий, однако, дополнительного изучения с целью оценки его влияния на дальнейшее развитие эмбриона и его потенциала к имплантации.

Биопсия бластоцисты — метод биопсии эмбриона на 5—6-е сутки развития, в котором дифференцированы трофэктодерма и внутренняя клеточная масса (ВКМ). Впервые применение метода биопсии трофэктодермы с целью преимплантационной диагностики эмбриона описано K. de Boer и соавт. [22]. О рождении ребенка в результате переноса эмбриона после биопсии трофэктодермы сообщено в 2005 г. сразу двумя группами исследователей [23, 24]. При биопсии бластоцисты изымаются несколько клеток трофэктодермы, как правило, с полюса, противоположного ВКМ. Для проведения процедуры биопсии эмбрионам проводят вспомогательный хетчинг на 3—4-е сутки развития [23], или же хетчинг производится непосредственно перед биопсией [25]. В первом случае к моменту проведения биопсии эмбрион, как правило, частично выходит из блестящей оболочки. Стеклянной пипеткой захватывают клетки трофэктодермы, вышедшие из оболочки, и отделяют их или механически, или при помощи лазерной пушки. При заблаговременном хетчинге существует вероятность, что при выходе из блестящей оболочки эмбриона будет лидировать ВКМ. В этой ситуации возможна биопсия трофэктодермы эмбриона после полного выхода его из оболочки. В случае хетчинга, проведенного непосредственно перед биопсией, есть возможность сориентировать эмбрион для наиболее безопасного и удобного положения ВКМ, однако в этом случае требуется вводить биопсийную пипетку под блестящую оболочку и «вытягивать» клетки трофэктодермы из оболочки эмбриона, далее проводится отделение этих клеток при помощи лазера или механически. Анализ полученных при биопсии клеток требует времени, поэтому после биопсии трофэктодермы эмбрионы криоконсервируют. Перенос пригодных эмбрионов проводят в криоцикле. Учитывая высокий потенциал таких эмбрионов, обычно практикуют перенос одного эмбриона. Это предотвращает развитие СГЯ и наступление многоплодной беременности [26, 27]. Следует отметить, что метод биопсии бластоцисты получил широкое распространение благодаря развитию технологии витрификации эмбрионов, которая позволяет сохранить высокий репродуктивный потенциал эмбриона при замораживании и последующем размораживании. Напомним, проведение процедуры биопсии трофэктодермы не оказывает влияния на выживаемость и имплантационный потенциал эмбрионов [20]. Необходимо также отметить возможное влияние эмбрионального мозаицизма на результат диагностики, взятие нескольких клеток трофэктодермы делает анализ более точным. Однако в случае диагностики методом NGS может быть выявлено присутствие в биоптате клеток, например с разным набором хромосом. В этом случае требуется интерпретация результатов с целью определить целесообразность переноса эмбриона.

Для проведения преимплантационной генетической диагностики необходимо получение ДНК. Как правило, образец ДНК получают из одной или нескольких клеток, взятых путем механического изъятия из эмбриона на разных стадиях его развития. Однако такое механическое воздействие на эмбрион может быть сопряжено с риском его повреждения [28]. В настоящее время активно идут поиск и разработка новых методов получения внеклеточной ДНК, так, в 2013 г. обнаружено наличие внеклеточной ДНК в содержимом полости бластоцисты, причем показано, что эта ДНК соответствует ДНК эмбриона [29]. Процедура аспирации жидкости из полости бластоцисты получила название бластоцентеза, ранее этот метод применялся для коллапсирования бластоцисты перед процедурой криоконсервации. Стеклянной микропипеткой осуществляется пункция клеток полюса трофэктодермы, противоположного ВКМ, и производится изъятие жидкости из полости бластоцисты. Как правило, в результате процедуры удается получить относительно небольшое количество жидкости (около 0,01 мкл) для дальнейшего анализа [30]. Анализ полученного аспирата проводили методом ПЦР в сочетании с полногеномной амплификацией. Геномная ДНК присутствовала примерно в 90% проанализированных образцов. Высказано предположение, что фрагменты ДНК, находящиеся в жидкости бластоцеля, попадают туда в результате апоптоза клеток трофэктодермы и ВКМ. Показана возможность определения пола эмбриона путем амплификации мультикопийных генов TSPY1 (на Y-хромосоме) и TBC1D3 (на хромосоме 17). В случае амплификации обоих генов пол определяли как мужской. Это открывает новые возможности для пар с носительством Х-сцепленных нарушений для идентификации мужских эмбрионов с высоким риском заболевания. В другой работе [31] сделана попытка исследования анеуплоидий эмбрионов путем анализа ДНК, полученной из полости бластоцеля. Большинство (76,5%) образцов жидкости бластоцеля дало положительные сигналы на наличие ДНК. В качестве контроля проведена биопсия клеток трофэктодермы всех бластоцист. При сравнении данных плоидности, полученных при диагностике жидкости бластоцеля, с данными биопсии полярных телец и бластомеров выяснилось, что из 29 образцов, полностью соответствующих по хромосомному составу контрольным данным, только 6 оказались эуплоидными. В остальных 23 случаях установлена анеуплоидия. Таким образом, сделан вывод о возможности рассмотрения жидкости бластоцеля в качестве материала для диагностики анеуплоидии. При анализе хромосомного состава в 82% случаев сигналы образцов жидкости бластоцеля полностью совпадали с контрольными сигналами от клеток трофэктодермы. Причина расхождения сигналов в оставшихся случаях, предположительно, заключалась в явлении мозаицизма между клетками трофэктодермы и ВКМ, так как ученые предполагали, что геномная ДНК из полости бластоцисты может принадлежать не только клеткам трофэктодермы, но и клеткам ВКМ.

В 2015 г. группа российских ученых также опубликовали работу с описанием молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК, полученной из полости бластоцеля, диагностику проводили методом сравнительной геномной гибридизации. Показано соответствие внеклеточной ДНК и ДНК клеток бластоцисты [32]. По другим данным [33], при сравнении результатов биопсии жидкости из полости бластоцисты и биопсии трофэктодермы различия в кариотипах выявлены в 52% случаев.

Анализ аспирата бластоцеля может проводиться также методом NGS, при этом, по данным одной из публикаций [34], 84% образцов содержали ДНК, пригодную для исследования. Показано также, что в аспирате полости бластоцеля может детектироваться не только ядерная, но и митохондриальная ДНК, что существенно расширяет спектр выявляемых нарушений [35]. В недавних работах описана недостаточно высокая статистическая значимость диагностики генетического статуса эмбриона, причем указано несовпадение ДНК, полученной при аспирации полости бластоцисты, с биоптатом трофэктодермы и ВКМ. O. Tšuiko и соавт. [36] исследовали 16 криоконсервированных донорских бластоцист, из них 10 образцов аспирата полости бластоцисты и 14 образцов трофэктодермы и ВКМ оказались пригодными для анализа хромосом методом NGS. Только 40% молекулярных кариотипов, определенных в аспирате полости бластоцисты, полностью совпадали с таковыми трофэктодермы и ВКМ, в то время как соответствие между трофэктодермой и ВКМ отмечено в 85,7%. Кроме того, в аспирате полости бластоцисты выявлены множественные мозаичные анеуплоидии.

В это же время другая группа исследователей [37] проводили анализ ДНК, полученной из полости бластоцисты методами количественной флюоресцентной полимеразной цепной реакции (КФ-ПЦР) и однонуклеотидного полиморфизма (SNP — Single nucleotide polymorphism). Целью было определить в том числе пригодность использования ДНК, полученной при аспирации полости бластоцисты и из среды культивирования эмбриона, для диагностики моногенных заболеваний. Установлено, что при диагностике моногенных заболеваний в аспирате полости бластоцисты и среды культивирования эмбриона в 2,9 и 20,8% случаев получен результат как и при исследовании трофэктодермы эмбриона. При этом образцы ДНК, полученной из полости бластоцисты, показали меньший уровень несоответствия результатов диагностики, а также контаминации, как посторонней, так и материнской ДНК. При анализе на анеуплоидии аспирата полости бластоцисты показана высокая частота отказов амплификации — 65,2%, а также всего 37,5% соответствия ДНК аспирата и ДНК, полученной при биопсии. Таким образом, авторы полагают, что аспирация полости бластоцисты не является надежным методом для получения ДНК с целью диагностики моногенных заболеваний.

Получение ДНК эмбриона для дальнейшего исследования в ходе ПГТ методом бластоцентеза представляет большой интерес, однако целесообразны дальнейшие исследования для повышения эффективности и точности метода [37].

Анализируя развитие вспомогательных репродуктивных технологий, можно сделать вывод о том, что биопсия эмбриона является неотъемлемой частью проведения преимплантационного генетического тестирования. Развитие техник биопсии идет рука об руку с развитием методов молекулярно-генетического анализа. При проведении этой манипуляции необходимо сохранение качества эмбриона и его потенциала к имплантации. В настоящее время все чаще используется метод биопсии трофэктодермы бластоцисты на 5—6-е сутки развития. Он позволяет получить достаточное количество ДНК при минимальном повреждении эмбриона. Однако и другие методы биопсии эмбриона могут применяться в определенных случаях. Перспективным представляется метод бластоцентеза. Минимальное воздействие на эмбрион при таком способе получения ДНК является важным фактором, делающим необходимым совершенствование техники бластоцентеза и методов молекулярно-генетического анализа полученной ДНК с целью повышения их чувствительности и точности. Биопсия эмбриона для хромосомного скрининга является эффективным средством профилактики хромосомных заболеваний новорожденных и самопроизвольных патологических прерываний беременности по причине хромосомной патологии плода. Проведение преимплантационного генетического тестирования моногенных заболеваний дает возможность избежать рождения больных детей у супружеских пар с носительством заболевания. Квалификация эмбриолога, выполняющего процедуру биопсии, имеет решающее значение для успешности процедуры. Безукоризненное проведение биопсии эмбриона и получение достаточного количества информативного материала для генетической диагностики позволяют оптимизировать эмбриологический этап экстракорпорального оплодотворения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare n conflict of interest.

Сведения об авторах

Краснопольская К.В. — д.м.н., проф., член-корр. РАН; https://orcid.org/0000-0003-3412-9868

Сесина Н.И. — https://orcid.org/0000-0001-7357-6682

Воскобоева Е.Ю. — e-mail: e_voskoboeva@mail.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Краснопольская К.В., Сесина Н.И., Воскобоева Е.Ю. Использование различных методов биопсии эмбриона для преимплантационного генетического тестирования. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-50. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Сесина Н.И. —
e-mail: sesina@mail.ru