В связи с получением данных о принципах регуляции нервной и иммунологической систем на основе нейропептидов возникли новые подходы к изучению воспаления и появлению нового направления — нейрогенное воспаление (НВ). НВ — это активация нейроиммунных клеток и их переход в провоспалительное состояние [1].

В настоящее время известно, что НВ активируется вследствие процессов старения, загрязнения воздуха, окислительного стресса и инфекции, которые приводят к увеличению провоспалительных медиаторов, таких как оксид азота (NO), индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS) и циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2). Накопление NO, iNOS инициирует нитрозативный стресс и способствует избыточному синтезу провоспалительных компонентов и тем самым увеличивает факторы риска инициирования нейродегенерации [2].

Первоначально НВ наблюдалось при нейродегенеративных заболеваниях [3], однако в последующем НВ изучалось и при ряде других состояний, например при аллергических и аутоиммунных заболеваниях [4].

Одной из отличительных особенностей эутопического эндометрия у женщин с эндометриозом является выявление нейропептида PGP9.5, отражающего признаки нейрогенного воспаления и характеризующего уровень демиелинизированных сенсорных нервных волокон в функциональном слое эндометрия [5].

Показано распределение плотности нервных микроволокон в эутопическом эндометрии у больных с эндометриозом и установлено, что их плотность в эутопическом эндометрии у пациенток контрольной группы для PGP9.5 в 1 мм² составила 1,2±1,1, а у больных с эндометриозом — 11,15±4,9, и различия статистически значимы (р<0,001). Случаев отсутствия положительной реакции на PGP9.5 не было [6]. Следовательно, эутопический эндометрий у больных с перитонеальной формой эндометриоза содержит избыточную плотность нервных микроволокон, что является патогномоничным иммуногистохимическим признаком эндометриоза [7, 8].

Следует отметить, что выполненные различными учеными многочисленные исследования содержания в эутопическом и эктопическом эндометрии нейропептидов как предполагаемых маркеров боли не смогли показать молекулярные механизмы выявленных изменений и установить причины их накопления.

Это связано и с тем, что иммуногистохимический анализ, вестерн-блоттинг (Western Blots, WB) и оценка экспрессии гена PGP9.5 в ткани эндометрия требуют использования стандартных протоколов и их оптимизации. Показано, что экспрессия мРНК PGP9.5 в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом и тазовой болью значительно повышена, иммуногистохимический анализ подтвердил присутствие белка PGP9.5 в эндометрии, однако при этом не наблюдалось увеличения плотности PGP9.5 нервных волокон. Нервные волокна без PGP9.5 отсутствовали у всех женщин без эндометриоза [8]. Исследования содержания PGP9.5 и других нейрогенных маркеров с использованием WB в эутопическом эндометрии женщин с эндометриозом и хронической тазовой болью не показали различий с данными контрольных измерений [9, 10].

Нами в 2018 г. доказана роль воспаления микроокружения в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и хронической тазовой болью и показано участие в этом процессе вазоактивного интестинального пептида (VIP), являющегося нейрональным пептидом и одним из главных участников НВ [11]. Кроме того, показана роль нитрозативного стресса в пролиферативном потенциале ткани эктопического эндометрия с акцентом на эпителий желез и эндотелий сосудов. Установлено влияние iNOS в эндотелии сосудов на пролиферативную активность и апоптоз в эпителии желез эктопического эндометрия при эндометриозе [12].

Дальнейшим этапом исследований является данная работа, выполненная для получения объективных результатов о роли нитрозативного стресса, а именно нейрональной синтазы оксида азота (nNOS) и iNOS в сосудах эутопического и эктопического эндометрия, в усилении экспрессии нейропептидов: убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1 (UCHL1) (Ubiquitin Carboxy-Terminal Hydrolase L1, Ubiquitin Carboxyl-terminal Esterase L1, ubiquitin c-terminal hydrolase, neuron-specific pgp 9.5), VIP и реализации боли у больных с эндометриозом. Это связано с необходимостью оценки влияния воспаления микроокружения в реализации боли за счет предполагаемого избыточного накопления нейропептидов этими тканями и их влияния на процессы, сопряженные с этим накоплением.

Цель исследования — оценить вклад нейрогенного воспаления в усиление экспрессии нейропептидов и реализацию боли у больных с эндометриозом.

Основная группа. Под наблюдением находились 85 женщин в возрасте 27—37 лет с перитонеальной формой эндометриоза I—III стадии согласно классификации Американского общества репродуктивной медицины (rASRM) [13], установленного во время проведения лапароскопии, как это описано нами ранее [11]. Больные распределены на две группы: без наличия признаков хронической тазовой боли — 34 больных и с наличием признаков хронической тазовой боли — 51.

Сравнительная группа — 32 женщины репродуктивного возраста с глубоким инфильтративным эндометриозом и хронической тазовой болью, как это описано нами ранее [14].

Контрольная группа — 53 пациентки, которым произведена стерилизация с использованием лапароскопического доступа. Эндометриоз у пациенток этой группы исключили после исследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов, как это описано ранее [11].

Дизайн исследования. Выполнено ретроспективное одномоментное исследование, одобренное этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Информированное согласие на участие в исследовании и использование крови и ткани эндометрия получено у всех пациенток. Рандомизацию и рекрутинг больных осуществляли совместно: для основной и контрольной групп с д.м.н., проф. А.С. Гаспаровым, д.м.н. Н.И. Волковым, д.м.н. Т.Е. Самойловой, д.м.н. Е.Д. Дубинской, д.м.н. Е.А. Межевитиновой, д.м.н. А.В. Лединой, к.м.н. М.А. Шороховой, к.м.н. М.Ф. Дорфманом, к.м.н. Н.С. Щетининой, к.м.н. А.С. Онищенко, врачом О.М. Векилян, врачом К.Р. Набиевой, для сравнительной группы с д.м.н., проф. Л.В. Адамян.

Характеристика образцов ткани эндометрия и сыворотки крови. Образцы эутопического и эктопического эндометрия получены во время лапароскопии, как это описано нами ранее [11]. Верификацию диагноза путем гистологического исследования эутопического и эктопического эндометрия осуществляли в Академической больнице Уппсалы (Швеция). Образцы эктопического эндометрия содержали эндометриальный железистый эпителий, окруженный стромальной тканью и сосудами. Образцы ткани у больных с глубоким инфильтративным эндометриозом и хронической тазовой болью представляли собой измененную эндометриоподобную ткань вне матки. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром перед операцией.

Сокращения обозначений обследованных групп для исследования тканей: ЭУК/Б– — эутопический эндометрий, контроль, без боли; ЭУЭ/Б– — эутопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭУЭ/Б+ — эутопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ЭКЭ/Б– — эктопический эндометрий, эндометриоз, без боли; ЭКЭ/Б+ — эктопический эндометрий, эндометриоз, с болью; ГИЭ/Б+ — глубокий инфильтративный эндометриоз, с болью.

Сокращения обозначений обследованных групп для исследования крови и перитонеальной жидкости: К/Б– — контроль, без боли, Э/Б– — эндометриоз, без боли, Э/Б+ — эндометриоз, с болью, ГИЭ/Б+ — глубокий инфильтративный эндометриоз, с болью.

Иммуногистохимический анализ. Иммуногистохимическое окрашивание эутопического и эктопического эндометрия проводилось в условиях стандартного протокола, как это описано нами ранее [15]. Неспецифического окрашивания не было. Серия образцов изучена как минимум 2 раза.

Экспрессия iNOS и nNOS в сосудах эутопического и эктопического эндометрия. В качестве первичных антител использованы для iNOS: NOS2 (C-11): sc-7271, «Santa Cruz Biotechnology, Inc» (США), для nNOS: NOS1 (A-9): sc-376751, «Santa Cruz Biotechnology, Inc» (США). Позитивным контролем оценки окрашивания для NOS1 и NOS2 служили образцы миометрия. В группе позитивного контроля получено ожидаемое окрашивание. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания в баллах (SCORE) оценивали в 5 предлежащих областях при 400-кратном увеличении: 0 — сравнима с негативным контролем, 1 — при слабом окрашивании (едва видно, но не более), 2 — между слабым и сильным окрашиванием, 3 — сильное окрашивание. Уровень SCORE не зависел от экспериментальных данных.

Экспрессия UCHL1 и VIP в эутопическом и эктопическом эндометрии. Исследование экспрессии VIP и UCHL1 в сосудах выполнено иммуногистохимическим методом в условиях стандартного протокола, как это описано нами ранее [11]. Для визуализации применяли поликлональные антитела к VIP (AB982; «Emd Millipore Corp. Company», США), для UCHL1 — кроличьи поликлональные антитела (аnti-PGP9.5, z5116, «Dako», Дания) и систему визуализации EnVision G|2 System/AP, Permanent Red («Agilent Technologies Inc.», США).

Определение плотности UCHL1 и VIP в эктопическом и эутопическом эндометрии проводили, как описано нами ранее [11], в стандартных условиях с использованием иммуногистохимического метода и последующей цифровой обработкой данных с помощью программы Image-Pro Plus. Для визуализации микрососудов использовали кроличьи поликлональные антитела к VIP (AB982; «Emd Millipore Corp. Company», США), для UCHL1 — кроличьи поликлональные антитела (аnti-PGP9.5, z5116, «Dako», Дания) и систему визуализации EnVision G|2 System/AP, Permanent Red, «Agilent Technologies, Inc.», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Показатель плотности VIP и UCHL1 выражали как среднюю интенсивность окрашивания ×% от площади на мм².

Проведение WB для nNOS, VIP, UCHL1. Суммарный белок из эутопического и эктопического эндометрия женщин контрольной группы, эутопического и эктопического эндометрия больных с эндометриозом без боли и с болью, сравнительной группы с болью выделяли и анализировали, как описано нами ранее [11]. Использовали кроличьи моноклональные антитела к nNOS (anti-nNOS, neuronal, antibody, EP1855Y, ab76067, «Abcam», США), кроличьи поликлональные антитела к VIP (AB982, «Emd Millipore Corp. Company», США), кроличьи поликлональные антитела к UCHL1 (аnti-PGP9.5 antibody, z5116, «Dako», Дания), мышиные моноклональные антитела к Actinβ (C4) (sc-47778, «Santa Cruz Biotechnology, Inc », США).

Проведение извлечения РНК и количественной полимеразной цепной реакции (PCR) в реальном времени (RT-qPCR) для nNOS, VIP, UCHL1. Суммарную РНК экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) после разрушения образцов ткани в TissueLyser II («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкциями производителя и как описано нами ранее [11]. Использовали праймеры «Thermo Fisher Scientific» (США): nNOS, Hs00167223_m1, интестинальный VIP, Hs00175021-m1, UCHL1 (UCHL1, Hs00175021-m1), человеческий β-актин (ACTB, 4326315E) в качестве эндогенного контроля. Относительные изменения экспрессии генов проанализированы с использованием метода 2-ΔΔT [16].

Анализ сыворотки крови и перитонеальной жидкости. Определение содержания UCHL1 (нг/мл) проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с применением стандартных наборов (ABIN422553). Оценку содержания NOS (нг/мл) проводили с использованием калориметрического метода («BioVision», США). Анализ содержания VIP (нг/мл) проводили с помощью ИФА с применением стандартных наборов (EK-064−16, «Phoenix Pharmaceuticals, Inc.», США) и гематологическим контролем («R&D Systems», США). Проведение реакций и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях согласно рекомендациям производителя.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как среднее и стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применяли ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна—Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05.

Описание больных основной группы. Клинические данные у больных с перитонеальной формой эндометриоза по сравнению с исследуемыми контрольной группы характеризовались стандартными критериями: бесплодием, хроническими тазовыми болями, метроррагиями, диспареунией, а при лапароскопии — различной локализацией гетеротопий на брюшине. Результаты оценки клинических данных показали, что возраст и индекс массы тела у больных с эндометриозом без боли и с болью статистически значимо не различались между собой. В то же время статистически значимо дисменорея наблюдалась чаще у пациенток группы без боли, а сочетание дисменореи и диспареунии — у пациенток группы с болью. Хроническая тазовая боль статистически значимо чаще наблюдалась у больных с болью — 0,0 по сравнению с 4,8 балла по визуальной аналоговой шкале (ВАШ). Отсутствовали статистически значимые различия между исследуемыми группами по распространенности эндометриоза на брюшине (критерии rASRM). Эти результаты позволили провести сравнение изученных показателей в перитонеальной жидкости, крови, эктопическом и эутопическом эндометрии обследованных. Детальная клиническая характеристика больных представлена нами ранее [11].

Описание больных сравнительной группы. У всех 32 женщин основным симптомом заболевания являлась боль, что соответствовало от 5,5 до 8,3 балла по ВАШ, они имели обширный эндометриоз в области малого таза и рост эндометриоидных гетеротопий в области ректовагинальной перегородки. У 4 пациенток выявлено частичное разрушение эндометриозом стенки прямой кишки, примыкающей к ректовагинальной перегородке, у 23 женщин стенка прямой кишки повреждена, но не разрушена ректовагинальными гетеротопиями, у 5 женщин ректовагинальные эндометриотические гетеротопии объединены с эндометриомами яичников. Степень выраженности эндометриоза соответствовала III—IV стадиям по rASRM во всех случаях. При гистологическом исследовании выявлено, что все образцы эндометриотических поражений содержали очаги железистого эпителия эндометрия, окруженные стромальной или мышечной тканью. У больных наблюдались олигоменорея, метроррагии или менометроррагии. В соответствии с гистопатологией эндометрия и уровнем прогестерона в сыворотке крови у женщин отсутствовала овуляция, т. е. они находились в состоянии ановуляции или в пролиферативной фазе менструального цикла [14].

Сравнение экспрессии nNOS, iNOS, VIP в сосудах (SCORE), плотности на 1 мм² ткани UCHL1 и плотности на 1 мм² ткани VIP по данным иммуногистохимического анализа эндометрия у пациенток групп ЭУК/Б–, ЭУЭ/Б–, ЭКЭ/Б+. Как следует из данных, приведенных в табл. 1, наименьшая

Сравнение экспрессии nNOS, iNOS, VIP в сосудах (SCORE), плотности на 1 мм² ткани UCHL1 и плотности на 1 мм² ткани VIP по данным иммуногистохимического анализа эндометрия у женщин исследуемых групп ЭКЭ/Б– и ЭКЭ/Б+, в измененной эндометриоподобной ткани вне матки пациенток группы ГИЭ/Б+. Как следует из данных, приведенных в табл. 2, наименьшая

Сравнение относительного уровня белка nNOS, VIP, UBLH1 по данным WB в эндометрии женщин групп ЭУК/Б–, ЭУЭ/Б–, ЭКЭ/Б–, ЭУЭ/Б+, ЭКЭ/Б+ и в измененной эндометриоподобной ткани вне матки у пациенток группы ГИЭ/Б+. Результаты представлены в табл. 3.

Сравнение относительной экспрессии nNOS мРНК, VIP мРНК, UBLH1 мРНК (по данным RT-qPCR) в эндометрии женщин групп ЭУК/Б–, ЭУЭ/Б–, ЭКЭ/Б–, ЭУЭ/Б+, ЭКЭ/Б+, измененной эндометриоподобной ткани вне матки женщин группы ГИЭ/Б+. Результаты изучения экспрессии nNOS мРНК, VIP мРНК, UСLH1 мРНК в эктопическом и эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом в зависимости от тазовой боли представлены в табл. 4.

Сравнение содержания NOS, UCHL1, VIP в крови и в перитонеальной жидкости у больных с перитонеальной формой эндометриоза и хронической тазовой болью и у больных с ГИЭ/Б+. Как следует из данных табл. 5, статистически

Отмечено, что у женщин контрольной группы и у больных с эндометриозом и без боли содержание NOS, UCHL1, VIP статистически значимо увеличено в крови по отношению к перитонеальной жидкости. У больных с болью эти показатели в крови и перитонеальной жидкости статистически незначимы.

Блок-схема генерации боли в эктопическом и эутопическом эндометрии под влиянием воспаления микроокружения, нитрозативного стресса, нарушения протеосомальной деградации белков, нейрогенного воспаления и патологического нейрогенеза у больных с эндометриозом. На рисунке

Убиквитин-опосредованная деградация белка играет решающую роль в различных клеточных процессах, включая передачу сигнала, дифференцировку клеток и ответ на стресс. UCHL1 является деубиквитинизирующим ферментом, который отщепляет убиквитин от белков. UCHL1 экспрессируется преимущественно в мозге и нейроэндокринных системах и составляет 1—2% от общего количества растворимых в мозге белков [17, 18].

Сообщалось о дисфункции UCHL1 при многих нейродегенеративных заболеваниях и повреждениях мозга. Так, наблюдалось увеличение содержания UCHL1 в крови и цереброспинальной жидкости при неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатии, связанной с перинатальной асфиксией новорожденных и являющейся основной причиной смерти, патологического неврологического поведения и длительной инвалидности [19]. Кроме того, показано, что наличие UCHL1 является общепризнанным сывороточным биомаркером при тяжелой черепно-мозговой травме и может быть использовано для определения степени ее тяжести. По мнению авторов [20], этот метод является надежным, быстрым, экономичным и простым. Он имеет чувствительность и специфичность 100% и соответствует аналитическому уровню чувствительности 0,5 нг/мл. Одновременное измерение концентрации UCHL1 и глиального фибриллярного астроцитарного белка (GFAP) в крови у больных с острым инсультом и здоровых людей показало высокие концентрации у больных (р<0,0001) [21].

В то же время имеются данные об изменении содержания UCHL1 при других состояниях, например при воспалительных изменениях и раке. Концентрации UCHL1 в крови у больных с острым аппендицитом были наиболее высокими до операции, а через 24 и 72 ч после операции медленно уменьшались, но не достигали референсных значений. По мнению авторов, концентрация UCHL1 может отражать метаболический ответ на состояние острого воспаления и процесс постепенного угасания воспаления. Отмечена статистически значимая отрицательная корреляция между уровнями С-реактивного белка, преальбумина и UCHL1. Следовательно, высокая концентрация UCHL1 в крови может сдерживать развитие воспаления [22]. При определении концентрации UCHL1 в сыворотке крови детей после термического повреждения обнаружено повышение концентрации до 6,94 нг/мл через 3 дня после травмы при норме 0,12 нг/мл [23]. Показано, что метилирование аберрантного промотора UCHL1 может считаться потенциальным молекулярным маркером для рака желудка и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом [24].

Известно, что аутосомно-доминантная форма паркинсонизма связана с геном UCHL1. В 1998 г. E. Leroy и соавт. [25] зарегистрировали миссенс-мутацию в 93 кодоне гена UCHL1 у членов немецкой семьи, страдающих аутосомно-доминантной формой паркинсонизма. Данная мутация вызывает частичную потерю каталитической активности UCHL1 и сопровождается нарушением каскада протеолиза в клетке, что способствует агрегации белков.

Как показали проведенные исследования, измененное сопряжение сигнальных путей воспаления микроокружения, нитрозативный стресс, нарушения протеосомальной деградации белков приводят к формированию феномена накопления нейропептидов, которые и обусловливают наличие нейрогенного воспаления, патологического нейрогенеза и боли. Следствием этих изменений может быть не только боль, но и нарушение процессов аутопаракринной регуляции и вовлечение других сигнальных путей, что подтверждено нами в 2006 г. [26].

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что при сравнительном анализе содержания синтазы оксида азота, убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1, вазоактивного интестинального пептида в перитонеальной жидкости и крови (иммуноферментный анализ), экспрессии нейрональной синтазы оксида азота, индуцибельной синтазы оксида азота, вазоактивного интестинального пептида в сосудах, плотности убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1 и вазоактивного интестинального пептида (иммуногистохимический анализ), экспрессии белка нейрональной синтазы оксида азота, убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1, вазоактивного интестинального пептида (вестерн-блоттинг), экспрессии мРНК нейрональной синтазы оксида азота, мРНК убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1, мРНК вазоактивного интестинального пептида (полимеразная цепная реакция) в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и тазовой болью показали статистически значимое увеличение изученных показателей. Следовательно, на протеомном и транскриптомном уровнях доказана роль нитрозативного стресса, вызванного нейрональной и индуцибельной синтазами оксида азота, что приводит к усилению экспрессии нейропептидов вазоактивного интестинального пептида и убиквитин карбоксил-терминальной гидролазы L1 в эутопическом и эктопическом эндометрии у больных с эндометриозом и тазовой болью. Это связано с нарушением «дренажной» функции протеасом, накоплением белков, не подвергнувшихся деградации, и началом проявления нейрогенного воспаления. Полученные результаты могут быть использованы для оценки вклада нитрозативного стресса в реализацию боли при нейрогенном воспалении и выбора тактики лечения.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава Р.Ф. «Разработка подходов для неинвазивной диагностики эндометриоза на основе омиксных технологий», № госрегистрации: АААА-А19−119021490132−9 на период 01.01.2019—31.12.2021.

Благодарности. Выражаем благодарность professor M. Olovsson, PhD C. Moberg, PhD Th. Kunovac Kallak, E. Davey Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Работа выполнена по теме: «Изучение ассоциации между эндометриальными маркерами эутопического и эктопического эндометрия и тазовой болью у женщин с эндометриозом», учетный номер Минобрнауки России в НТИМИ 0431/01/15. Финансовая, научная, правовая и политическая поддержка осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (гранд № 8683), Фондом планирования семьи в Уппсале, Университетом Уппсалы (Швеция), ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Министерством здравоохранения Российской Федерации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Б.В.А., И.Н.А.

Сбор и обработка материала — Б.В.А., И.Н.А.

Статистическая обработка — Б.В.А., И.Н.А.

Написание текста — Б.В.А., И.Н.А.

Редактирование — Б.В.А., И.Н.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Бурлев В.А. — врач, д.м.н., проф., ведущий научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: vladimir.burlev@kbh.uu.se; e-mail: vbourlev@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-5271-2478

Ильясова Н.А. — врач, научный сотрудник ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; e-mail: natalia.ilyasova @kbh.uu.se; e-mail: natalia_ilyasova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0665-3515

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Бурлев В.А., Ильясова Н.А. Нейрогенное воспаление: нейропептиды и синтазы оксида азота у больных с эндометриозом и тазовой болью. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-77. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Бурлев В.А. —
e-mail: vladimir.burlev@kbh.uu.se; e-mail: vbourlev@mail.ru