Хронический риносинусит (ХРС) рассматривают как многофакторный и гетерогенный процесс с отклоняющимися от нормы реакциями иммунной защиты организма [1—3]. С ХРС часто ассоциированы системные и местные факторы: мукоцилиарные дисфункции, астма, аллергия [4], непереносимость аспирина, иммунодефициты, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, анатомические вариации, формирование биопленок [5], остеиты. В патогенез ХРС вовлечены персистирующее воспаление слизистой оболочки и микробный дисбиоз, а также сниженное бактериальное разнообразие [3, 6, 7].
Эпителиальная поверхность носа и околоносовых пазух является областью активного взаимодействия между проникающими в дыхательные пути патогенами и молекулярно-клеточными факторами иммунной системы [6]. Эпителиальные клетки помимо функции физического барьера несут на себе Toll-подобные рецепторы (TLR), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны. Активация этих рецепторов врожденного иммунитета инициирует воспалительный каскад, направленный на освобождение от агрессивных патогенов и приведение в действие адаптивных иммунных реакций [8].
TLR2 считают рецептором типовых маркерных компонентов клеточной стенки грамположительных бактерий. В форме гетеродимеров TLR2/TLR1 и TLR2/TLR6 он вовлечен в распознавание широкой панели микробных лигандов: липопротеинов и липопептидов различных патогенов, липотейхоевых кислот грамположительных бактерий, бактериальных пептидогликанов, липоарабиноманнанов микобактерий, фенолорастворимого модулина и поринов Staphylococcusepidermidis и Neisseriaspp., атипичных липополисахаридов Leptospirainterrogans и Porphyromonasgingivalis, гликоинозитолфосфолипидов и гликолипидов паразитов Trypanosoma spp., Toxoplasmagondii и Plasmodium spp., β-гликанов и маннанов грибков, белка теплового шока HSP60 Chlamydiapneumoniae, сердцевинного и неструктурного белка NS3, dUTPаз и гликопротеинов вирусов парагриппа, гепатита, Эпштейна—Барр, цитомегаловируса и респираторно-синцитиального вируса, а также эндогенных метаболитов (белка теплового шока HSP70) [8, 9].
Цель исследования — оценить экспрессию гена TLR2 на основе определения матричных РНК (мРНК) в поверхностном эпителии слизистой оболочки носа и околоносовых пазух больных хроническими воспалительными заболеваниями.
Материал и методы
Материалом для исследования служили 85 образцов слизистой оболочки носа и околоносовых пазух (см.таблицу), полученные от 84 больных во время планового хирургического вмешательства в условиях общей анестезии. Образцы немедленно помещали в стабилизирующий раствор RNAlater. В качестве контроля служили образцы ткани нижних носовых раковин больных с искривлением перегородки носа (контроль 1) и образцы здоровой ткани слизистой оболочки среднего носового хода, полученные попутно в ходе операций (контроль 2). Хирургическое лечение проведено пациентам в период вне обострения заболевания.
Молекулярно-генетические исследования включали выделение общей РНК из операционного материала (поверхностный эпителий); синтез комплементарной ДНК в реакции обратной транскрипции; амплификацию с использованием специфических праймеров и флюорофора SYBR Green методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [10]. Уровень экспрессии мРНК стандартизировали относительно экспрессии гена β-актина (housekeepinggene).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы GraphPad Prism 5 с использованием непараметрических критериев различия. Значения p<0,05 рассматривали как статистически значимые.
Результаты и обсуждение
Экспрессия гена TLR2 детектирована во всех исследованных образцах слизистой оболочки носа и околоносовых пазух (см.рисунок). Статистически достоверные различия обследованных групп не выявлены.
Сведения литературы об экспрессии гена TLR2 в слизистой оболочке носа и околоносовых пазух противоречивы. Большинство авторов сообщают о постоянной детекции мРНК TLR2 в исследованных образцах слизистой оболочки методами полимеразной цепной реакции [2—4, 6, 7, 11—13] и гибридизации insitu [14, 15], но локальная экспрессия гена TLR2 не детектирована в носовых полипах средней носовой раковины и крючковидного отростка колонизированных Staphylococcusaureus и особенно грибами Aspergillus spp. больных [1].
Повышенная экспрессия мРНК TLR2 при ХРС, диагностированном на основании анамнестических, эндоскопических и рентгенологических (уровень воздух—жидкость) критериев, встречается в литературе чаще [3, 5, 13—15], чем пониженная [7] или незначимые различия ХРС и контроля [6, 11, 16].
При хроническом полинозном риносинусите (ХПРС) показаны изменения экспрессии гена TLR2 в сторону как повышения [2, 3, 16], так и понижения [1, 7]. При этом у больных с ранним постоперационным рецидивированием полипов экспрессия мРНК TLR2 достоверно ниже, чем у чувствительных к хирургическому лечению пациентов [2]. Ряд работ также свидетельствует об отсутствии различий между ХПРС и контролем [11—13].
В исследованиях в качестве контроля используют нижние носовые раковины [3, 4, 11—13], браш-биопсии той же области слизистой оболочки носа здоровых добровольцев [1, 14, 15], образцы слизистой оболочки резецированных крючковидных отростков и передней решетчатой пазухи пациентов с невоспалительными заболеваниями, подвергнутых эндоскопическому хирургическому вмешательству на пазухах [2, 5—7]. Часть имеющихся работ выполнена на эпителиальных клетках носа [14, 15], в большинстве случаев исследована цельная ткань (гомогенаты слизистой оболочки) [1—7, 11—13, 16].
Недостатком исследования цельной ткани авторы считают вариабельность местоположения ее происхождения у больных и множество и непостоянство типов клеток в пределах эпителия и субэпителия (реснитчатые, дендритные и секреторные клетки, макрофаги, инфильтрирующие нейтрофилы и др.) [1, 3, 5, 7, 11, 12, 16], иногда даже подлежащей надкостницы и кости [2, 6]. Смешанные образцы ткани содержали эпителий, фибробласты, иммунные и воспалительные клетки, поэтому клеточный источник измеренной мРНК не установлен. Наблюдаемые различия между ХРС и контролем могут в большой мере отражать скорее вклад инфильтрирующих воспалительных клеток, чем нормальных резидентных популяций клеток. Повышение экспрессии гена TLR2 в ткани ХРС по сравнению с контролем может быть в значительной степени обусловлено наличием мРНК TLR2 в проникающих лейкоцитах, которые отсутствуют в контрольной ткани, в то время как уровень экспрессии TLR2 эпителиальными клетками может быть неизменным или даже сниженным [6]. Например, иммуногистохимически белок TLR2 обнаруживается преимущественно в макрофагах интраэпителиального и субэпителиального слоя, его содержание повышено при ХПРС (p=0,033) и ХРС (p=0,009) по сравнению с контролем [3].
Ряд авторов сообщают о применении кортикостероидов и антибиотиков в предоперационном периоде [2, 3, 6, 7], однако в литературе есть сведения о способности кортикостероидов повышать экспрессию генов врожденного иммунитета. В частности, показано, что в первичных эпителиальных клетках дыхательных путей кортикостероиды синергически повышают индуцированную нетипируемыми штаммами Haemophilusinfluenzaeэкспрессию гена TLR2 [17]. Учитывая широчайший спектр лигандов TLR2, аналогичные изменения могут наблюдаться и в случае постоянной микробной нагрузки верхних дыхательных путей.
В целом расхождение данных многих авторов может быть обусловлено различными критериями диагностики ХРС и принятыми в разных странах показаниями к оперативному лечению, разнообразием критериев отбора больных и контрольных групп, применением кортикостероидов, различием участков биопсии тканей, исследованных молекулярно-генетическими методами.
В нашей работе благодаря использованию микрометода выделения общей РНК (20—40 мг ткани) удалось охарактеризовать преимущественно эпителиальную экспрессию гена TLR2. В качестве контроля нами использованы два наиболее популярных в литературе и одобренных локальным этическим комитетом варианта биопсии, но различия экспрессии мРНК TLR2 в поверхностном эпителии различной локализации анатомической области «нос и околоносовые пазухи» в норме и при разных патологических процессах, в том числе ятрогенных, нами не обнаружены.
Сигнальные пути TLR инициируют экспрессию большого набора генов, белки которых поддерживают воспалительные и иммунные реакции против внедряющихся патогенных микроорганизмов [1, 2, 5, 13—15]. Поэтому они могут участвовать как в защите, так и в патогенезе заболеваний и наносить ущерб организму в процессе развития гиперактивных иммунных реакций, таких как сепсис или локальные воспалительные заболевания [2, 3, 6, 7, 9, 16]. В то же время через эти рецепторы могут реализовываться иммунные реакции, поддерживающие состояние транзиторной толерантности к безвредным ингаляционным антигенам и комменсальной микробиоте [8]. Экспериментально показано, что в слизистой оболочке кишечника сигнальный путь TLR2 участвует в поддержании режима толерантности к колонизирующим слизистую комменсалам микробиоты человека и достижении симбиоза хозяин—нормальная микробиота [18]. Можно предположить, что повсеместная экспрессия гена TLR2 в постоянно колонизированной слизистой оболочке носа и околоносовых пазух в норме и условиях ремиссии хронического воспалительного заболевания выполняет скорее всего толерогенную, а не реактивную в отношении микроорганизмов функцию.
Заключение
Таким образом, в условиях планового хирургического лечения хронических воспалительных заболеваний носа и околоносовых пазух экспрессия гена TLR2 детектирована во всех образцах поверхностного эпителия слизистой оболочки на уровнях, которые достоверно не различались. По-видимому, экспрессия гена TLR2 в поверхностном эпителии носа и околоносовых пазух не является фактором, приводящим к хроническому и неконтролируемому воспалению слизистой оболочки или поддерживающим персистирующее воспаление. Вероятно, низкие уровни активации гена TLR2 в поверхностном эпителии слизистой оболочки носа и околоносовых пазух играют важную роль в регуляции гомеостатической толерантности к комменсалам или неконтролируемому размножению микробов.
Конфликт интересов отсутствует.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования, редактирование: Ю.Я., В.К.
Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста: Е.Т., Г. А.