Введение

В педиатрической практике аденоиды и аденоидиты фигурируют как наиболее частая причина затрудненного носового дыхания, составляя от 20 до 50% обращений за медицинской помощью, а в группе часто болеющих детей — от 37 до 70% [1]. При этом аденоиды (аденоидные вегетации) как реактивная гиперплазия лимфоидной ткани глоточной миндалины не являются самостоятельной нозологической формой, а представляют собой обязательный и закономерный компонент местных инфекций верхних дыхательных путей. Расположенная в своде носоглотки между глоточными отверстиями слуховых труб глоточная миндалина благодаря ретроназальному направлению мукоцилиарного транспорта взаимодействует с разнообразными микроорганизмами и другими частицами антигенной природы, попадающими в полость носа и околоносовых пазух вместе с вдыхаемым воздухом [2, 3].

Кроме того, на поверхности и в лакунах глоточной миндалины вегетирует микрофлора, составляющая микробиом слизистой оболочки носоглотки, которая находится под контролем местной иммунной системы [4]. Доказательством непрерывной антигенной стимуляции глоточной миндалины является ее иммунный ответ в виде гиперплазии лимфоидной ткани с образованием вторичных лимфоидных фолликулов и клональной пролиферацией B-лимфоцитов в герминативных центрах [5]. Вторичные фолликулы с герминативными центрами появляются в лимфоэпителиальных органах глотки уже к концу второй недели после рождения ребенка и служат основной морфологической структурой адаптивного иммунитета [6].

Вследствие антигенной стимуляции наивные B-лимфоциты с IgM-мембранным иммуноглобулином поступают в микроокружение первичного лимфоидного фолликула и с помощью T-клеток, экспрессирующих хемокиновый рецептор CXCR 5, начинают пролиферировать и клонально заселять последний, образуя герминативный центр (центр размножения). С появлением светлого центра размножения лимфоидный фолликул называется вторичным. [7]. По современным данным клональная пролиферация активированных B-клеток (центробластов и центроцитов) сопровождается формированием B-клеточных рецепторов вариабельной области иммуноглобулинов, что происходит путем соматических гипермутаций соответствующих генов, кодирующих V, D и J сегменты будущего рецептора. Данный механизм позволяет создавать большое разнообразие рецепторов, которые могут обладать разной степенью аффинности к антигену, а также рецепторы с аутоиммунной направленностью. Одновременно с этим процессом гены константных доменов иммуноглобулинов переносят ряд рекомбинаций, известных как переключение классов иммуноглобулинов, то есть определяют появление антител различных классов (IgM, IgD, IgA, IgG, IgE). Механизм генетических рекомбинаций позволяет осуществить изотипическое разнообразие иммуноглобулинов в роли антител.

Таким образом, соматические гипермутации генов вариабельной области и рекомбинационные переключения генов константной области, приводящие к изотипическому разнообразию иммуноглобулинов, составляют главную особенность онтогенеза B-лимфоцитов герминативных центров, происходят на стадии центробластов и частично центроцитов. Центробласты и центроциты, способные производить высокоаффинные антитела, подвергаются отбору при участии клеток микроокружения, включая фолликулярные дендритные клетки (позитивная селекция). Центробласты, не способные секретировать высокоаффинные антитела или имеющие «вредные» мутации генов вариабельной области иммуноглобулинов (нефункциональный B-клеточный рецептор), а также обладающие аутореактивностью, погибают путем CD95/Fas опосредованного апоптоза [8—10] — отрицательная селекция.

Особенностью постмитотических B-лимфоцитов является приобретение внутриклональной гетерогенности вариабельной области генов иммуноглобулинов вследствие дальнейших мутаций. Центроциты, способные производить высокоаффинные специфические антитела, дифференцируются в долго живущие плазматические клетки, запрограммированные на секретирование большого количества определенных антител, либо становятся B-клетками памяти, способными к распознаванию антигена при повторной стимуляции. При дифференцировке B-клеток памяти наблюдается переключение синтеза иммуноглобулинов с мембранного на секреторный тип.

Реализация механизмов соматических гипермутаций генов вариабельной области иммуноглобулинов и переключения константных генов осуществляется с помощью индуцируемой активации дезаминазы цитидина — специфического фермента, экспрессируемого B-лимфоцитами герминативных центров. Следует подчеркнуть, что инициация и реализация адаптивного иммунного ответа в лимфоэпителиальных органах, в том числе в глоточной миндалине, происходит при участии рецепторов и ко-рецепторов врожденной иммунной системы, включая Толл-подобные и другие распознающие рецепторы [11, 12], а также системы цитокинов, образуемых активированными клетками при их взаимодействии [13, 14].

В результате адаптивного иммунного ответа, кратко описанного выше, образуются клоны специфически реагирующих B-лимфоцитов, которые, пройдя через лимфо- и гемоциркуляцию, по механизму хоуминга возвращаются в соответствующую область слизистой оболочки, обеспечивая «иммунное вооружение» последней [14, 15]. Для B-лимфоцитов, родившихся в глоточной миндалине, такой эффекторной «рабочей» областью является слизистая оболочка носа, околоносовых пазух и самой носоглотки. Поскольку адаптивный иммунный ответ лимфоидного органа сопровождается гиперплазией вторичных фолликулов, целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональной характеристики вторичных фолликулов в аденоидах в условиях современной терапии с использованием иммуномодуляторов.

Цель исследования — оценка морфофункционального состояния структур адаптивного иммунного ответа глоточной миндалины на основе возрастной динамики вторичных фолликулов в аденоидах в условиях иммунотропной терапии.

Материал и методы

Объектом исследования служили аденоиды 120 детей в возрасте от 22 месяцев до 16 лет, оперированных в связи с гиперплазией глоточной миндалины II—III степени. Среди них в 50 случаях аденотомия была выполнена вместе с тонзиллэктомией у детей с хроническим декомпенсированным тонзиллитом (8 детей), гипертрофией небных миндалин с синдромом СОАС (25 детей) и синдромом Маршалла (17 наблюдений). Все дети оперированы в сроки не менее 4 недель от последнего респираторного заболевания.

Для клинико-морфологического анализа, по данным анамнестического обследования, оперированные дети были распределены на три группы:

— 1-я группа — получавшие стандартную терапию респираторных заболеваний без использования иммунотропных препаратов;

— 2-я группа — получавшие иммунотропную терапию (в основном иммуномодуляторы микробного происхождения) вместе с протокольным лечением;

— 3-я группа — получавшие в последние три-четыре месяца перед операцией только иммунотропные препараты (бронхомунал, имудон, ИРС19, ликопид).

Дети всех трех групп были сопоставимы по полу и возрасту, морфологический анализ в каждой группе проводился с учетом возрастной динамики становления иммунной системы ребенка [16] с выделением в каждой группе возрастных подгрупп: от 1 года до 3 лет 11 месяцев (подгруппа А), от 4 лет до 7 лет 11 месяцев (подгруппа B) и от 8 до 16 (подгруппа C) лет.

Операционный материал при макроскопическом исследовании при необходимости подвергался измерению путем погружения в физиологический раствор в мерном цилиндре и определялся объемом вытесненной жидкости. Эта процедура выполнялась далеко не во всех случаях, так как материал мог поступать после шейверной аденотомии или парциальной аденотомии. Поэтому основным источником морфологических данных о гиперплазии лимфоидной ткани аденоидов служили микроанатомические, гистологические и иммуногистохимические исследования. Микроанатомическая оценка учитывала соотношение площади диффузной и фолликулярной лимфоидной ткани и предполагала дифференциацию вторичных фолликулов по размерам (очень крупные, крупные, средние, мелкие) и плотности расположения в диффузной лимфоидной ткани (разбросанные, сближенные, соприкасающиеся в виде гиперпластических фолликулярных модулей). С помощью гистологического исследования, которое выполнялось на парафиновых срезах с использованием окраски гематоксилином и эозином, уточняли клеточный состав и особенности тканевой организации структурных областей удаленных аденоидов. При необходимости применяли дополнительные методы окраски пикриновым фуксином по ван Гизону, метил-грюн пиронином по Браше, окраску альциановым синим и ШИК-реакцию.

Иммуногистохимическое исследование выполнялось на серийных парафиновых срезах отобранных образцов не менее чем в 6 случаях из каждой возрастной группы. Панель моно- и поликлональных антител включала основные дифференцировочные маркеры T- и B-лимфоцитов (CD3, CD4, CD5, CD8 и CD19, CD20, CD79a, соответственно), маркеры клеток макрофагально-моноцитарной системы (CD68, CD21), маркер пролиферации (Ki67), антиапоптотический маркер (Bcl-2), проапоптотический маркер — молекулу P-53. Постановку реакций осуществляли согласно протоколам, прилагаемым фирмами — производителями антител. Предварительно проводили высокотемпературную демаскировку антигена путем кипячения срезов в цитратном pH 6,2 или трис-ЭДТА pH 9,0 буфере в СВЧ-печи одним циклом, нагревая буфер до 95—97 °С в течение 20 мин с последующим охлаждением. Остывшие препараты промывали в PBS буфере (pH 7,2—7,3) и для инактивации эндогенной пероксидазы обрабатывали 0,3% перекисью водорода на метаноле (1:9) с последующим нанесением раствора альбумина (Universal Block, BioGenex). Первичные антитела экспонировали на срезах в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим трехкратным промыванием в буфере. Для визуализации реакции применяли готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами, меченными хромогеном: HRP-polymer Detection system, BioGenex (3,3’-диаминобензидин — ДАБ) и Histophine, Nichirei Corp (3,3^’-диаминобензидин). На последнем этапе выполняли фоновое окрашивание гематоксилином Майера и заключали под покровное стекло. Позитивные результаты иммуногистохимических реакций учитывали при наличии двух негативных контролей — на специфичность антител и на отсутствие активности эндогенной пероксидазы. Гистопрепараты изучали и фотографировали на микроскопе Leica DM 5000. Полученные результаты анализировали с помощью программы Statistica 7. Установленные различия считали статистически значимыми при значении уровня достоверности ниже 0,05 (p<0,05).

Результаты

Макроскопическими измерениями установлено, что средний объем удаленных аденоидов составил 2,6±0,81 см^3. При этом максимальный размер достигал 3,5 см³ и наблюдался преимущественно у детей, получавших иммунотропную терапию. Гистологические исследования позволили объяснить увеличенный объем органа за счет нарастания клеточности структурных компартментов лимфоидной ткани, включающей диффузную и фолликулярную части. Обращали на себя внимание различия в соотношении площади диффузной и фолликулярной лимфоидной ткани, которые оказались связанными с возрастом детей. Так, в 1-й группе аденоиды детей в возрасте от 1 года до 4 лет (подгруппа A) имели обширную диффузную лимфоидную ткань с единичными первичными фолликулами, в которой были разбросаны редкие, но очень крупные вторичные фолликулы. В аденоидах детей от 4 до 8 лет (подгруппа B) вторичные фолликулы крупных и средних размеров по занимаемой площади преобладали над диффузной лимфоидной тканью. В подгруппе C (от 8 до 16 лет) аденоиды отличались наличием мелких и средних фолликулов, неравномерно разбросанных в диффузной лимфоидной ткани, что не исключало присутствия единичных вторичных фолликулов более крупных размеров.

Нарастание величины фолликулярного компартмента объяснялось размножением (пролиферацией) B-клеток на стадии центробластов в темной зоне гер минативного центра у нижнего полюса вторичного фолликула, где были сосредоточены многочисленные фигуры деления. Здесь же появлялись первые макрофаги, поглощающие апоптотические тела, что указывало на начало негативной селекции. Увеличение герминативных центров в размерах сочеталось с проникновением в срединную светлую зону, состоящую из центроцитов, малых лимфоцитов из T-зависимой диффузной лимфоидной ткани — феномен, получивший название «интернализация T-лимфоцитов». Этот феномен, отражающий T-клеточную помощь B-клеткам герминативного центра, сопровождался нарастанием апоптоза, усилением макрофагальной реакции до картины «звездного неба» и свидетельствовал о продолжающейся селекции специфически реагирующих B-клеток (рис. 1, 2). В апикальной части герминативного центра и покрывающей ее лимфоцитарной короне появлялись клетки плазмоцитоидного типа с положительной окраской цитоплазмы по Браше.

Рис. 1. Обилие макрофагов в герминативном центре — картина «звездного неба».

Окраска гематоксилином и эозином, ×50.

Рис. 2. Поглощение макрофагами апоптотических телец — отрицательная селекция.

Окраска гематоксилином и эозином,×400.

Во 2-й и 3-й группах аденоиды также обнаруживали определенную возрастную динамику в виде гиперпластических пиков у детей дошкольного и школьного возраста. Однако направленного возрастного инволютивного снижения фолликулярной гиперплазии в препубертатном и пубертатном возрасте, отмеченного у детей 1-й группы, не наблюдалось. Так, аденоиды детей подгруппы C (от 8 до 16 лет), особенно из 3-й группы, отличались не просто крупными вторичными фолликулами, но их близким расположением друг к другу, а зачастую они почти соприкасались герминативными центрами, разделенными узкой 1—2-рядной прослойкой лимфоцитов мантийной зоны. Подобные фолликулярные модули составляли основу вертикальных складок аденоидных вегетаций с большой объемной массой, достигающей 3,5 см³ (рис. 3). Они встречались и в аденоидах подгрупп B у детей 2-й и 3-й групп, но практически отсутствовали в подгруппе A, где вторичные фолликулы были представлены разбросанными округлыми образованиями разной величины. Общим признаком для вторичных фолликулов аденоидов 2-й и 3-й групп была нарастающая интернализация герминативных центров малыми лимфоцитами, появление аберрантных фолликулов с нарушенной гистоархитектоникой (рис. 4), уменьшение клеточности в отдельных фолликулах с появлением протеиногенного вещества. Аналогичные изменения вторичных фолликулов были выявлены и в небных миндалинах детей с аденотонзиллэктомией, получавших антибактериальную терапию вместе с иммунотропным лечением. Однако полного соответствия в структуре герминативных центров фолликулов в аденоидах и небных миндалинах не отмечалось.

Рис. 3. Гиперплазия вторичных фолликулов в виде фолликулярного модуля при лечении иммуномодуляторами.

Окраска гематоксилином и эозином, ×50.

Рис. 4. Вторичный фолликул аберрантного строения в аденоидах мальчика 3 лет 6 мес.

Окраска гематоксилином и эозином, ×100.

При иммуногистохимическом исследовании установлено, что основную массу клеток герминативных центров вторичных фолликулов аденоидов из всех групп составляют созревающие B-лимфоциты (центробласты и центроциты), позитивные по CD19, CD20 и CD79a. Интернализованные лимфоциты представлены CD3 позитивными T-клетками, в основном CD4+ T-хелперами. Встречались небольшие группы и единичные CD5+ T-клетки; лимфоциты иммуносупрессивного фенотипа CD8+ в герминативных центрах отсутствовали. Особенностью герминативных центров в аденоидах детей 2-й и 3-й групп было нарастание в них количества Bcl-2+ лимфоцитов, обладающих антиапоптотическими свойствами. В светлых центрах с высоким содержанием Bcl-2+ клеток апоптотические тела и их фагоцитоз CD68+ макрофагами встречались в меньшем количестве. В общем, соотношение T-хелперов, Bcl-2+ клеток и CD68+ макрофагов в клеточном составе центров отдельных фолликулов варьировало, являясь, скорее, характеристикой конкретных фолликулов, чем группы в целом. Однако признак высокой экспрессии молекулы Bcl-2 в герминативных центрах фолликулов во 2-й и 3-й группах с учетом их количества отражал, по нашему мнению, определенную тенденцию к изменению функционального состояния этих структур (рис. 5).

Рис. 5. Экспрессия антиапоптотического протеина Bcl-2 в герминативном центре аденоидов мальчика 6 лет при курсовом лечении иммуномодулятором ИРС 19.

Иммуногистохимическая реакция, ДАБ, ×200.

Особого внимания заслуживает экспрессия молекулы Ki67 — маркера пролиферации, подтверждающая пролиферативную природу нарастания клеточной массы аденоидов и ее возрастную динамику. Так, в подгруппах A всех трех групп высокая экспрессия Ki67 в герминативных центрах сочеталась с увеличенной экспрессией этой молекулы в лимфоцитах широкой зоны парафолликулярной диффузной лимфоидной ткани. В подгруппах B (в возрасте от 4 до 8 лет) высокая экспрессия Ki67 в герминативных центрах в части случаев сочеталась, а в части случаев преобладала над выраженностью экспрессии Ki67 в диффузной лимфоидной ткани T-клеточной зоны. В подгруппе C (в возрасте от 8 до 16 лет) 1-й группы экспрессия маркера пролиферации снижалась как в герминативных центрах, так и в парафолликулярной диффузной лимфоидной ткани. В отличие от 1-й группы аденоиды детей в возрасте 8—16 лет 2-й и 3-й групп обнаруживали высокую экспрессию Ki67 в герминативных центрах большинства фолликулов, при этом в 3-й группе отмечена и активация пролиферативной активности в диффузной лимфоидной ткани (рис. 6). В старшей возрастной подгруппе из 2-й и 3-й групп встречались также мелкие и средние фолликулы с уменьшением клеток, экспрессирующих Ki67, — «лысеющие» фолликулы.

Рис. 6. Высокая экспрессия молекулы Ki-67 в герминативных центрах аденоидов при курсовом лечении иммуномодуляторами.

Иммуногистохимическая реакция, ДАБ, ×100.

Во всех герминативных центрах с признаками пролиферации наблюдалась экспрессия молекулы P53, сосредоточенная в основном в зоне центробластов, за исключением «лысеющих» фолликулов, где эспрессия P53 резко падала. Гиперплазированные фолликулы имели хорошо развитую сеть дендритных клеток, особенно плотную в светлой части герминативного центра. В аденоидах детей 2-й и 3-й групп, получавших иммунотропные препараты, наблюдали фолликулы с дезинтеграцией сети фолликулярных дендритных клеток (рис.7). Такие фолликулы чаще встречались в аденоидах детей 2-й группы и детей с хронической сочетанной воспалительной патологией небных миндалин. Во 2-й и 3-й группах макрофагальная реакция в герминативных центрах наблюдалась вместе с выраженной экспрессией молекулы CD68 моноцитарными клетками диффузной лимфоидной ткани.

Рис. 7. Дезинтеграция фолликулярных дендритных клеток в герминативных центрах по экспрессии CD21 в аденоидах при иммунотропном лечении.

Иммуногистохимическая реакция, ДАБ, ×50.

Обсуждение

Полученные результаты относительно вариабельности структуры вторичных фолликулов аденоидов в разные возрастные периоды и при разных протоколах предшествующей терапии показали преимущественное нарастание пролиферативной активности структур адаптивного иммунитета в его гуморальном звене у детей, получавших иммуномодуляторы микробного происхождения. Эти данные являются далеко не исчерпывающими в морфофункциональной характеристике аденоидных вегетаций исследуемых групп. В настоящую публикацию не вошли материалы, касающиеся геморрагической составляющей лимфопролиферативных изменений в аденоидах, а также признаки индолентного лакунита, связанного с вегетацией актиномикотической флоры, присутствие которой могло отражать отклонения в состоянии микробиома глоточной миндалины [16]. Внимание к вторичным лимфатическим фолликулам и их герминативным центрам в аденоидных вегетациях связано с последними достижениями медико-биологической науки в области познания тонких механизмов межклеточных взаимодействий при иммунных и воспалительных реакциях, понимания роли цитокинов и генетических факторов в регуляции клеточного деления и контроля процессов пролиферации и дифференцировки клеток [18, 19]. Особенно значимым стало открытие распознающих рецепторов врожденного иммунитета и концепция главенствующей роли врожденного иммунитета в распознавании антигенов и инициации адаптивных иммунных реакций [20—22]. В свете сказанного морфофункциональная оценка состояния вторичных фолликулов аденоидных вегетаций является основой для понимания онтогенеза развивающихся специфически реагирующих B-клеток и роли герминативного центра как истинного микроокружения для созревающих клонов. В клинико-морфологическом плане структурная динамика вторичных фолликулов в аденоидах может служить связующим звеном между фундаментальными знаниями и особенностями клинической симптоматики гиперплазии глоточной миндалины с развитием назальной обструкции. Сравнение морфофункционального состояния вторичных фолликулов в аденоидах у детей выделенных клинических групп показало не только связь с иммунотропным лечением, но и зависимость пролиферативного потенциала от микрокружения герминативного центра, образованного клетками врожденного иммунитета (ФДК и клетками моноцитарно-макрофагальной системы).

Заключение

Гиперплазия вторичных фолликулов в аденоидах на фоне стандартного лечения воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей имеет определенную возрастную динамику с пиками повышения у детей дошкольного и школьного возраста и тенденцией к падению пролиферативной активности в препубертатном и пубертатном возрасте. У детей со стандартным лечением с одновременным добавлением иммуномодуляторов возрастная динамика пролиферации сдвигается в сторону старшей группы, может усиливаться у детей школьного и пубертатного возраста и сочетается с появлением фолликулов с дезорганизованными герминативными центрами.

У детей, получавших иммунотропное лечение в последние месяцы перед операцией, пролиферативная активность вторичных фолликулов также усиливается и сдвигается в сторону препубертатного и пубертатного возраста, зачастую приобретая форму фолликулярных модулей. Однако дезорганизованные фолликулы в этой группе встречались реже, чем во II. Полученные данные, указывающие на иммуномодуляторы как дополнительную антигенную нагрузку, позволяют поставить вопрос о нецелесообразности назначения иммуномодуляторов одновременно со стандартной терапией. Возможно, следует уточнить протокольные сроки назначения иммунотропной терапии, предусматривающие временной интервал между стандартным медикаментозным лечением и назначением иммуномодуляторов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.П. Быкова, А.Г. Рязанская, А.С. Юнусов

Сбор и обработка материала — А.Г. Рязанская

Статистическая обработка — А.Г. Рязанская

Написание текста — В.П. Быкова

Редактирование — В.П. Быкова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<