В последние годы в практике стоматологического материаловедения все шире используются различные композитные материалы, стеклоиономерные цементы, акриловые пластмассы, полиуретан, стекловолоконные и прочие полимеры для протезирования, имплантации, реставрации и реконструкции зубных рядов [1—3]. Поскольку все эти изделия прямо или косвенно контактируют с тканями организма человека, в частности, пародонтом, эмалью и дентином, слизистой оболочкой полости рта, к ним предъявляются жесткие санитарно-гигиенические требования. Однако в перечне требований отсутствуют нормативы, касающиеся колонизации этих материалов резидентной и патогенной микрофлорой [1, 4]. Вместе с тем, искусственные полимерные материалы, в том числе и материалы медицинского назначения, могут быть колонизированы микроорганизмами и подвергаться процессам биокоррозии или биодеструкции [3, 5—7]. Такого рода исследования наиболее актуальны в стоматологической практике, поскольку все используемые зуботехнические материалы длительное время находятся в ротовой полости, постоянно контактируя с микрофлорой, в составе которой могут быть патогенные виды бактерий и грибов [1, 2, 4]. Более того, способность патогенных микроорганизмов прикрепляться к предполагаемому для использования биоматериалу и его способность к формированию биопленки должны рассматриваться как важнейший фактор противодействия механизмам врожденного иммунитета и, соответственно, развития патологии [1, 3]. Особое значение имеет образование микробных биопленок на поверхности реставрационных (пломбировочных) материалов, используемых для лечения кариеса зубов и его осложнений. Установлено, что микробная биопленка активно образуется в пораженной инфекцией полости зуба, корневых каналах и даже дентинных канальцах [1, 7]. За последние годы появилось работы зарубежных и некоторых отечественных исследователей, которые посвящены изучению адгезии микробов к композитным материалам, стеклоиономерным цементам и пластмассам, используемым для реставрации зубного ряда и последующей колонизации с развитием типичной микробной биопленки смешанного типа [1, 8, 9]. Однако, этапность процесса формирования биопленки, механизмы регуляции, кворум-сенсинга, и особенности участия в этих процессах микроорганизмов разных типов остаются недостаточно изученными.
Цель исследования — изучить этапы формирования микробной биопленки на некоторых полимерных материалах медицинского назначения и продемонстрировать особенности персистенции в зависимости от участвующих этиологических агентов.
Материал и методы. Для проведения данного исследования были выбраны широко распространенные в медицинской практике полимерные пластмассы для производства съемных зубных протезов на основе полиуретана (Россия) и полиметилакрила (Украина). В исследованиях in vitro были выбраны клинические изоляты грамотрицательных и грамположительных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus для изучения процессов их взаимодействия с образцами полимеров.
Динамика процесса взаимодействия микроорганизмов с полимерными материалами была изучена с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы полимеров (пластины размером 1×1 см) помещались в питательный LB бульон (Luria-Bertani broth), в который предварительно засевали культуру бактерий в концентрации 106/мл. Инкубация образцов проводилась в термостате в течение 24, 48 ч и 7, 14 сут и в течение 1,5 и 3 мес при температуре 37 °C. При инкубации образцов дополнительного внесения питательной среды не производилось, и таким образом, стимулировался процесс образования биопленки в прогрессивно истощающейся среде [10].
Поверхности образцов полимерных пластмасс были изучены с помощью двулучевого сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (США) в режимах высокого вакуума, при ускоряющих напряжениях 5 и 10 кV, с предварительным напылением золотом (999) в установке SPI-Module Sputter/Carbon Coater System (США).
Для оценки морфофункционального состояния бактерий, длительно находившихся на поверхности искусственных материалов, было проведено ультраструктурное исследование соскобов биопленки. Образцы были приготовлены по общепринятой методике для исследования методом ультратонких срезов и проанализированы в просвечивающем электронном микроскопе JEM 100B (Япония).
Оценка жизнеспособности бактерий, сформировавших биопленку на сроках 1,5 и 3 мес, была произведена посредством посева бактериального налета с поверхности пластмасс в питательный бульон и на агаризированную 1% среду LB.
В клинической части исследования проводили сканирующую микроскопию образцов биопленки из корневых каналов, полученной путем соскоба у пациентов с хроническим апикальным периодонтитом.
Результаты. В результате проведенного исследования для всех изученных образцов были установлены общие закономерности взаимодействия микроорганизмов с поверхностью пластмасс, и процессы, связанные с формированием очагов бактериальной персистенции на искусственных полимерных материалах. Поэтапно процесс взаимодействия микроорганизмов с поверхностью пластмасс может быть представлен следующим образом.
Первый этап — образование безмикробной пленки. На сканограммах образование безмикробной пленки соответствует появлению участков более высокой электронной плотности. Данный этап является чрезвычайно важным для последующей успешной адгезии бактерий к пластмассам. Безмикробная пленка, состоящая из продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и компонентов питательной среды, меняет заряд поверхности с отрицательного на положительный, тем самым обеспечивая отрицательно заряженным бактериям прикрепление к поверхности за счет сил электростатического взаимодействия [7].
Второй этап — адгезия одиночных бактерий к поверхности. Наиболее интенсивно бактерии адгезировались в области дефектов, образовавшихся при механической обработке материала. На ранних сроках инкубации 24 ч синегнойная палочка, у которой хорошо развит жгутиковый аппарат, адгезируется лучше, чем безжгутиковый стафилококк. У безжгутиковых бактерий реализация адгезии происходит посредством увеличения экспрессии поверхностных адгезинов (белок Bap и экзополисахариды (PIA или PNAG), которые способствуют прикреплению к субстрату и обеспечивают межклеточные взаимодействия) [7, 10].
На третьем этапе происходило образование микроколоний (деление и объединение бактериальных клеток в единую структуру). На этом этапе можно было видеть начало синтеза экзоклеточного матрикса, который объединяет бактерии и является облигатным признаком формирования биопленки.
Четвертый этап — формирование зрелых биопленок с массивным экзоклеточным матриксом. Экзоклеточный матрикс, в состав которого входят гомо- и гетерополисахариды, уроновые кислоты, аминосахара и их сополимеры, белки, нуклеиновые кислоты, липополисахариды, различные минералы (кальций, фосфор и в небольших количествах магний, калий, натрий) выполняет защитную функцию, препятствуя диффузии бактерицидных агентов и действию физических факторов, таких как ультрафиолетовое облучение, изменений рН, осмотического шока, высыхания, участвует в образовании полимикробных биопленок [1, 3, 6].
Далее от зрелых биопленок отшнуровывались особые структуры — номады, состоящие из бактерий, окруженных матриксом. Кроме номад на поверхности биопленок были видны бактерии с четкими контурами без покрытия массивным экзоклеточным матриксом. Очевидно, что номады и поверхностно локализованные бактерии обеспечивают популяции распространение в окружающей среде. При длительной инкубации (1, 5 и 3 мес) синегнойная палочка и золотистый стафилококк находились на поверхности полимерных пластмасс в составе массивных биопленок. Биопленки могли фрагментарно отслаиваться от поверхности и растрескиваться, при этом внутри биопленки визуализировались морфологически сохранные бактерии. Возможно, растрескивание биопленки, так же как и номады, обеспечивает выход из нее жизнеспособных бактерий.
При длительной колонизации бактериями поверхности изученных полимеров происходит формирование дополнительных дефектов поверхности и увеличение объема ранее существовавших. Биодеструктивные изменения в пластмассах возникают в результате действия бактериальных эстераз (ферментов, расщепляющих эфирные связи полимеров) и продуктов их жизнедеятельности, в частности, органических кислот [5, 6].
В дефектах пластмасс бактериальные биопленки способны к длительному сохранению, поскольку надежно защищены от агрессивного воздействия внешней среды (механического удаления, воздействия антибактериальных препаратов). В связи с этим, можно обоснованно утверждать, что образованные на полимерных материалах биопленки обеспечивают длительную персистенцию патогенных для человека возбудителей, потенциально являясь очагами хронической инфекции.
Следует отметить, что в реальной клинической ситуации наличие биопленок в полости рта, в состав которых может входить патогенная микрофлора, создает угрозу развития воспалительных процессов не только локального порядка, но и для всего организма в целом. Это связано с возможной миграцией защищенных экзополиматриксом жизнеспособных бактерий в желудочно-кишечный и дыхательный тракт при глотании и вдыхании, а также диссеминации гематогенным и лимфогенным путем.
Анализ ультратонких срезов соскобов с поверхности пластмасс показал, что на ранних сроках инкубации до 14 сут в препарате были представлены в основном бактерии с сохранной структурой, типичной для вегетативных форм бактерий, и незначительное количество форм бактерий с дефектной клеточной стенкой (ДКС). С увеличением сроков инкубации в препаратах соотношение форм бактерий смещалось в сторону увеличения форм с ДКС, но сохранялись и бактерии в типичной вегетативной форме с признаками деления. На основе этих данных можно заключить, что бактерии в формирующихся биопленках сохраняют жизнеспособные клетки как в вегетативной форме, так и в формах с ДКС, способных к реверсии в типичные вегетативные формы.
Данные микроскопического исследования, свидетельствующие о морфофункциональной сохранности и соответственно жизнеспособности бактерий при длительном их нахождении на поверхности пластмасс в составе биопленок, были подтверждены бактериологически. Посев соскоба с поверхности биопленок пластмасс спустя 1,5 и 3 мес инкубации показал наличие жизнеспособных бактерий в биопленках, образовывавших колонии.
При исследовании типичной зрелой биопленки, полученной при соскобе из корневого канала «периодонтитного» зуба, мы обнаружили много общих элементов c морфологической картиной зрелой биопленки. В частности, выявлены элементы матрикса биопленки, а также кокковидные и палочковидные бактерии, собранные в скопления, сходные с теми, которые наблюдались в эксперименте in vitro на заключительном этапе сформировавшейся биопленки. Основным отличием, которое наблюдалось при исследовании зрелой биопленки из инфицированных корневых каналов, является ее смешанный полимикробный характер.
При развитии патологии пародонта (гингивит, пародонтит) существенную роль играют дрожжевые грибы рода Candida. В ряде случаев они доминируют в составе биопленки, что позволило некоторым авторам ввести в употребление термин кандида-ассоциированный пародонтит. Исследованные нами с помощью СЭМ этапы формирования биопленки дрожжевыми грибами Candida albicans отражают общие закономерности, ранее выявленные у бактерий. Так, в эксперименте со штаммами дрожжевых грибов Candida albicans, после адгезии на субстрате, происходило образование ростовой трубки, затем появлялись дочерние дрожжевые клетки — бластоспоры и нитевидные элементы, окруженные экзополимерным матриксом, хорошо различимым при большом увеличении. Особенностью этого процесса у дрожжевых грибов (эукариотов) в отличие от бактерий (прокариотов) является активное формирование псевдомицелия, который достаточно прочно связан с продуцируемыми полисахаридными компонентами матрикса.
Ведущее значение в процессе микробной адгезии и последующей колонизации с формированием биопленки, по-видимому, играет способность ряда бактерий (стрептококков, актиномицетов) к биосинтезу собственных экзополимеров, что хорошо видно при увеличении СЭМ от 3000 до 10 000. Считается, что развившийся на сахарозе внешний полисахаридный слой стрептококковой биопленки уменьшает активность нейтрофилов по уничтожению микробов. Совокупность полисахаридов и бактерий биопленки может индуцировать «стимул неподконтрольности фагоцитозу» и таким образом индуцировать разнообразные «нарушения фагоцитоза» [1, 2, 9]. Полисахариды могут быть не единственными компонентами среды в ротовой полости, которые индуцируют образование биопленки микроорганизмов. Мочевина, минералы, углекислый газ наряду с белками и глюкопротеинами служат источниками энергии и питания для бактерий, вызывающих кариес зубов и пародонтит. Влияние этих дополнительных факторов на фагоцитоз организма хозяина, процессы биосинтеза цитокинов, хемокинов, дефензинов (эндогенных антимикробных пептидов) и экспрессии TLR рецепторов требует дальнейших исследований [2, 5, 9].
Таким образом, проведенное исследование показало принципиальную возможность исследовать процессы взаимодействия микроорганизмов с искусственными материалами медицинского назначения в экспериментальных условиях.
Вывод. Разработанная экспериментальная модель образования биопленок на абиотических поверхностях может служить основой для проведения исследований с помощью СЭМ, которые позволят вести успешную борьбу с биопленками, формирующимися в естественных условиях при патологии зубов и пародонта. Применение микроскопических методов высокого разрешения (СЭМ) позволяет дать оценку и документировать особенности морфофункционального состояния, как самих бактерий, так и экзополиматрикса биопленок при использовании тех или иных антибактериальных средств. Сочетание микроскопических методов с традиционными бактериологическими методами исследования, посредством которых можно оценить состояние жизнеспособных бактерий, объективизирует оценку эффективности средств борьбы с биопленками.