Болезни пародонта представляют одну из наиболее актуальных проблем современной стоматологии, что связано с высокой распространенностью среди населения, в том числе лиц молодого возраста, с развитием тяжелых изменений в тканях пародонта и организме пациента в целом, а также все еще недостаточной эффективностью предлагаемых средств и методов лечения [1, 2].

По данным ВОЗ, распространенность болезней пародонта достигает 90—95% у взрослого населения и 80—83% у подростков, при этом прогрессирование заболевания и чередование стадий ремиссии и обострения часто сопровождаются значительными нарушениями функции зубочелюстной системы. Преобладание деструктивных форм заболевания приводит к частичной или полной потере зубов, общей сенсибилизации организма, снижению иммунитета, развитию одонтогенных очагов инфекции и сопровождается временной частичной потерей трудоспособности.

Распространенность болезней пародонта в Республике Беларусь среди 35—44-летних жителей, т. е. наиболее трудоспособной части населения, составляет 94,8% [3].

Среди современных методов по восстановлению тканей пародонта выделяется биопластический материал Коллост, который представляет собой децеллюляризованный дермальный матрикс на основе коллагена I типа. В хирургической пародонтологии Коллост применяется в качестве барьерного материала в комплексе операции по направленной тканевой регенерации, технология которой подробно освещена в учебно-методическом пособии коллектива авторов из Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова [4]. Эффективность коллагеновых материалов как кондуктивного элемента в первую очередь связывают с сохранением нативной структуры коллагена. Как гелевая форма биоматериал Коллост активно используется в общехирургической практике для регенерации мягких тканей в лечении хронических ран, трофических язв, синдрома диабетической стопы. Проведенные исследования и аналитические обзоры показывают высокую эффективность коллагенового биоматериала в лечении хронических раневых дефектов различной этиологии [5—9].

В конце 1990-х годов возникло новое направление реконструктивной хирургии — тканевая инженерия (tissue engineering), основанная на использовании культивированных клеток человека. Задачей этого направления является замещение или восстановление утраченных тканей за счет имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток здоровых тканей и органов [10, 11]. Тканеинженерные конструкции состоят из клеток и их носителя. Идеальным носителем могут выступать биоматериалы, такие как коллаген. Перспективным в данном направлении является Коллост.

Стволовые клетки — это клетки, способные к широкой специализации и сохраняющие эту способность (специализироваться) в течение длительного времени (в течение жизни). Стволовые клетки взрослого организма унипотентные, т. е, способны образовывать клетки только определенных тканей (крови, нервной системы и т. п.). Однако в последнее время в научной литературе стали появляться сообщения о так называемой направленной дифференцировке (трансдифференцировке) стволовых клеток взрослого организма, например из стволовых клеток костного мозга взрослого организма удалось в результате генетического перепрограммирования получать нервные, мышечные и другие клетки [12].

Основными ограничениями широкого применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для репаративной медицины являются инвазивность процедуры взятия исходного материала и количество выделяемых клеток [13].

В течение последних лет жировая ткань рассматривается как альтернативный костному мозгу источник получения мезенхимальных стволовых клеток. Это связано с рядом преимуществ, которыми обладает жировая ткань: ее технически проще получить, а содержание в жире стволовых клеток превосходит таковое в костном мозге. Исследования иммунофенотипа мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и красного костного мозга показали, что они практически идентичны друг другу. По данным специальной литературы, из 1 мл жира сразу после его забора можно выделить около 1 млн стволовых клеток, через 2 ч — 500 тыс., а через 18 ч хранения жира при 4 °C количество уменьшится еще на 50%. Однако, несмотря на разные сроки выделения клеток, их жизнеспособность составляет 90—98% [14].

Таким образом, изложенное выше указывает на целесообразность проведения аргументированных экспериментально-клинических исследований по применению в стоматологии мезенхимальных стволовых клеток, направленных на активацию процессов восстановления в тканях пародонта и позволяющих повысить эффективность лечения пациентов с рецессией десны.

Цель исследования — изучить характер клинических изменений в тканях патологически измененного пародонта с применением мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в лечении рецессии десны в эксперименте.

Экспериментальное исследование проводилось на базе ЦНИЛ Белорусской медицинской академии последипломного образования. Оперативное вмешательство выполняли на верхней и нижней челюстях крыс в области резцов.

До начала проведения экспериментальных исследований у одной особи в стерильных условиях производили забор жировой ткани в объеме 1—2 мл для получения аллогенных мезенхимальных стволовых клеток. Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток проводили в лабораторных условиях на базе ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси».

Для эксперимента в качестве модели использовали нелинейных, рандомбредных, беспородных самок белых крыс в количестве 60 особей. Масса тела животных составила 200—250 г. Крысы в виварии содержались в стационарных условиях в соответствии международными санитарно-гигиеническими стандартами.

Крыс содержали в пластиковых клетках с проволочной крышкой размером 52×30×24 см. Основной рацион животных состоял из зерна, овощей, крупяных каш с добавлением молока и кисломолочных продуктов и соответствовал санитарно-гигиеническим нормативам для вивариев. Пищу для животных хранили в специально отведенном месте и не подвергали дополнительной контаминации как при хранении, так и при раздаче животным. Водный режим обеспечивался свободным доступом к поилкам, использовали водопроводную воду, соответствующую требованиям СанПИН 10−124 РБ 99 к питьевой воде. Температура воздуха составляла 22—24 °С, влажность воздуха — 40—45%.

До начала эксперимента животные находились под карантинным наблюдением в течение 2 нед в виварии. Для эксперимента выбраны активные животные без видимых признаков заболевания с гладким, блестящим шерстным покровом, нормальной окраской видимых слизистых оболочек, охотно поедающие корм. После взвешивания на электронных весах были сформированы однородные по массе (разница не более 10%), поведению и состоянию контрольная и опытные группы. За 24 ч до испытания и во время его проведения животные находились в отдельном помещении с постоянной температурой, не отличающейся от температуры помещения, в котором животные содержались до опыта, более чем на 2,5 °С, изолированном от шума, в спокойной обстановке. В день начала эксперимента проведено дополнительное обследование и взвешивание животных.

Эксперименты начинались в одно и то же время суток — утром, учитывая хронобиологическую зависимость большинства физиологических и биохимических процессов в организме.

Все животные были разделены на пять групп в зависимости от планируемого метода лечения — по 10 крыс в каждой. Контрольную группу составили 10 лабораторных животных со здоровой десной — интактные крысы (рис. 1).

Первым этапом исследования явилось создание модели экспериментальной рецессии десны. У животных 1—5-й групп после предварительной анестезии (обезболивание достигали внутримышечным введением наркотических веществ (фентанил 0,005% + дроперидол 0,25% в соотношении 1:2) в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела животного) проводили операцию по созданию рецессии десны с вестибулярной поверхности в области резцов на верхней и нижней челюстях справа, а также в области зубодесневого сосочка на верхней и нижней челюстях.

Создание модели экспериментальной рецессии десны осуществляли путем механического иссечения тканей пародонта V-образной формы с вестибулярной поверхности твердосплавным шаровидным бором с использованием портативного микромотора. Зубодесневой сосочек между резцами иссекался вначале твердосплавным шаровидным бором, а затем скальпелем с целью формирования «черных треугольников» (рис. 2, а).

Учитывая различную степень плотности десневого края, а также величину прикрепленной десны на верхней и нижней челюстях, у всех животных создана экспериментальная рецессия десны в области нижнего резца справа размером 5 мм (рис. 2, б), в области резца верхней челюсти — 3 мм (рис. 2, в).

На втором этапе исследований на 10-е сутки после создания экспериментальной рецессии десны и завершения процесса эпителизации (рис. 3, а,

В 1-й группе находились 10 лабораторных животных с экспериментальной рецессией десны, у которых не проводили лечебные манипуляции на протяжении всего периода наблюдений.

В остальных группах под обезболиванием животным были выполнены следующие манипуляции.

Во 2-й группе животным проводили инъекции физиологического раствора в область экспериментальной рецессии десны (рис. 4).

В 3-й группе по аналогичной методике животным проводили инъекции стерильного биопластического коллагенового материала Коллост гель 7% в эквивалентном объеме.

4-я группа получала инъекции суспензии аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в физиологическом растворе. В 0,1 мл раствора 1 лабораторному животному вводилось 100 тыс. мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани.

5-я группа — инъекции смеси аллогенных мезенхимальных стволовых клеток и стерильного биопластического коллагенового материала Коллост гель 7% в эквивалентном объеме. В 0,1 мл смеси 1 лабораторному животному вводилось 100 тыс. мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани.

Инъекции в области слизистой десны проводились в объеме 0,02 мл, инъекции в области зубодесневого сосочка — 0,01 мл. Точки инъекций — 2 в области десны на верхней и 2 — на нижней челюсти, 1 в области зубодесневого сосочка на верхней и 1 — на нижней челюсти.

Выведение животных из эксперимента (по 5 особей из каждой группы наблюдения) осуществлялось на 14-е сутки от момента введения препаратов (24-е сутки от момента создания модели рецессии десны) и на 28-е сутки от момента введения препаратов (38-е сутки общего наблюдения).

По истечении срока наблюдения животные (опытных и контрольной групп) были выведены из эксперимента с соблюдением принципов биоэтики (в соответствии со стандартами GLP) на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного. При выведении животных из эксперимента производился забор костно-пародонтальных блоков челюстей крыс, содержащих зубы и ткани пародонта, для патоморфологических исследований.

Сроки послеоперационного наблюдения составили 14 и 28 сут, так как являются наиболее информативными для получения гистологической картины репаративного процесса.

Количество и численный состав групп животных является минимально необходимым для проведения экспериментов и определяется требованиями и рекомендациями к проведению экспериментальных исследований.

После выхода животных из наркоза наблюдали постепенное восстановление нормальной реакции на звуковые, световые и прочие раздражители. Состояние животных было удовлетворительным и соответствовало тяжести проведенного оперативного вмешательства.

Оценку состояния тканей пародонта, внешнего вида, поведения, состояние шерстного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек подопытных животных проводили в течение всего периода наблюдения.

Через 10 дней после формирования экспериментальной рецессии десны клинически определили картину рецессии десны с признаками воспаления во всех исследуемых группах. Величина рецессии составила 5,1±0,02 мм на нижней челюсти и 3,03±0,01 мм на верхней челюсти, десна гиперемирована, рыхлая, с неровным контуром, отмечалась легкая отечность, кровоточивость при зондировании.

Двигательная активность, питьевое и пищевое поведение животных 1—5-й групп не отличались от таковых у животных контрольной группы.

Через 14 дней после инъекций препаратов проведена оценка общего состояния животных и клинической картины рецессии десны.

В 1-й и 2-й группах было отмечено снижение массы тела лабораторных животных. Животные неохотно поедали корм (твердую пищу), так как это, вероятно, причиняло им боль, отмечалось снижение их активности. Была отмечена взъерошенность, шерстный покров имел значительные изменения.

Животные 3, 4 и 5-й групп как в начале эксперимента, так и при его завершении имели ровный, блестящий шерстный покров, травма челюсти не причиняла значительного беспокойства животному. Животные охотно поедали корм. Не было отмечено взъерошенности и каких-либо повреждений на теле животных.

В 1-й и 2-й группах визуально определялась рецессия десны 5,2±0,05 мм на нижней челюсти и 3,1±0,02 мм на верхней челюсти. Зубодесневой сосочек и десна имели выраженную гиперемию, наблюдалась легкая отечность, после удаления некротических участков десна кровоточила. В отдельных случаях на зубах отмечали наличие остатков пищи и фибринозный налет на десневом крае (рис. 5, а,

В 3, 4 и 5-й группах рецессия десны составила в среднем 3,4±0,04 мм на нижней челюсти и 2±0,05 мм на верхней челюсти. Сохранялись легкая отечность и гиперемия десны и зубодесневых сосочков, десневой край более ровный, плотной консистенции. В отдельных случаях определяли фибринозный налет в области зубодесневого сосочка и кровоточивость при зондировании (рис. 6, 7,

Через 28 дней в 1-й и 2-й группах исследования общее состояние животных ухудшалось. Отмечалось снижение двигательной активности, снижение массы тела, частичное выпадение шерсти. Воспалительные явления нарастали. В области рецессии десны и зубодесневых сосочков на верхней и нижней челюстях отмечали наличие некротических участков, резко выраженное воспаление десны с заметной гиперемией и отеком, рыхлой консистенции и с неровным изъеденным контуром (рис. 9, 10).

В 3, 4 и 5-й группах общее состояние животных удовлетворительное. Двигательная активность, состояние шерстного покрова, питание оставались удовлетворительными. В 3-й и 4-й группах рецессия десны сохранилась и составила 2,3±0,01 мм на нижней челюсти и 1,2±0,02 мм на верхней челюсти, также отмечена легкая гиперемия, десна достаточно плотная с ровным краем. Отсутствовали фибринозный налет и кровоточивость десны, а также произошло почти полное восстановление тканей зубодесневого сосочка (рис. 11, 12).

В 5-й группе через 4 нед после инъекций смеси мезенхимальных стволовых клеток и стерильного биопластического коллагенового материала Коллост гель 7% отмечали одинаковый уровень десневого края у правого и левого резцов, восстановлен зубодесневой сосочек. Десна розового цвета, плотная, с ровными краями как на верхней челюсти, так и на нижней, не кровоточит при зондировании. Также отмечается валикообразное утолщение по десневому краю в зоне инъекции (рис. 13).

Экспериментальные исследования показали возможность полного восстановления зубодесневых сосочков, а также регенерацию тканей пародонта в области экспериментальной рецессии десны в течение первых 28 дней. При этом регистрировалось полное отсутствие признаков воспаления в 5-й группе (гиперемии, отека, кровоточивости десны), а также значительное их уменьшение в 3-й и 4-й группах, что подтверждает выраженное лечебное действие мезенхимальных стволовых клеток и стерильного биопластического коллагенового материала Коллост гель 7%.

Изучение характера изменений в тканях патологически трансформированного пародонта под воздействием мезенхимальных стволовых клеток при лечении рецессии десны в эксперименте выявило положительную динамику: снижение интенсивности и распространенности воспаления десны начиная с 14-х суток; полное отсутствие признаков воспаления у животных после инъекции суспензии клеточного трансплантата на стерильном биопластическом коллагеновом материале Коллост гель 7% на 28-е сутки. Кроме того, отмечалось заметное нарастание процессов регенерации десневого края к 24-м суткам от момента создания модели рецессии десны, а к 38-м суткам общего наблюдения — полное восстановление зубодесневых сосочков и отсутствие рецессии десны.

Экспериментальные исследования выполнены в рамках отдельного проекта фундаментальных и прикладных исследований НАН Беларуси «Разработать биотрансплантат на основе мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, иммобилизованных на биодеградируемом носителе, для применения в лечении болезней пародонта» по заданию «Провести экспериментальные и клинические испытания биотрансплантата на основе мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, иммобилизованных на биодеградируемом носителе, для применения в лечении болезней пародонта» № госрегистрации 20164574 совместно с сотрудниками ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: rubnikovichs@mail.ru