В последние годы эндометриоз рассматривают как одну из ведущих причин развития бесплодия у женщин. Распространенность эндометриоза в популяции фертильных женщин составляет 0,5—10%, тогда как у женщин с бесплодием эндометриоз диагностируют, по данным разных авторов, в 25—50% наблюдений [1, 2]. Особого внимания заслуживает вопрос о механизмах развития бесплодия у пациенток с так называемыми малыми формами эндометриоза, поскольку при I—II стадии заболевания отсутствуют выраженные анатомические изменения, которые могут негативно влиять на фертильность женщин. В то же время при проведении диагностической лапароскопии у пациенток с бесплодием чаще выявляются именно малые формы эндометриоза [2]. До сих пор остается открытым вопрос о тактике ведения пациенток с бесплодием при малых формах эндометриоза. Доказано, что гормональное лечение не дает положительного эффекта в отношении фертильности пациенток с эндометриозом [1]. Хирургическое удаление очагов эндометриоза по-прежнему считается «золотым стандартом» при лечении всех стадий эндометриоза и связанного с ним бесплодия. При этом частота спонтанного наступления беременности после проведения лапароскопии у пациенток с малыми формами эндометриоза до сих пор остается невысокой и составляет, по данным разных авторов [3], 20—36%. В связи с этим некоторые авторы рекомендуют после лапароскопии проводить пациенткам с эндометриозом I—II стадии контролируемую стимуляцию яичников с последующей внутриматочной инсеминацией, а в отсутствие эффекта от лечения ориентировать женщин на проведение экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [1]. Однако многие исследователи [2] отмечают сравнительно невысокую эффективность процедуры ЭКО у пациенток с эндометриозом (30—38%). В последнее время появились сообщения о высоком риске повторного развития эндометриоза после проведения ЭКО, что связывают с высокими дозами эстрадиола, которые женщина получает при проведении стимуляции суперовуляции [2]. Таким образом, мы вынуждены констатировать, что до сих пор отсутствуют эффективные методы лечения пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием. Во многом это связано с отсутствием полного понимания механизмов, определяющих нарушение фертильности у этих пациенток.

Предполагают, что развитие бесплодия при эндометриозе может быть обусловлено рядом причин: 1) нарушением процесса фолликулогенеза, что обусловливает низкое качество яйцеклеток и эмбрионов; 2) нарушением транспорта яйцеклетки; 3) угнетением рецептивности эндометрия, что негативно влияет на имплантацию эмбриона; 4) изменением перитонеального микроокружения [4]. Кроме того, важную роль в развитии как самих эндометриоидных очагов, так и в нарушении фертильности у пациенток с эндометриозом отводят иммунным нарушениям [5]. Установлено, что при эндометриозе в перитонеальной полости повышено содержание макрофагов, активно продуцирующих многочисленные провоспалительные цитокины (IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-33, TNFα, MCP-1, MIF) и факторы роста (EGF, FGF, IGF, PDGF) [5], а это ведет к развитию локального воспаления и формированию условий, способствующих эктопическому росту эндометрия. В экспериментах in vitro было продемонстрировано прямое эмбриотоксическое действие цитокинов перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом, что свидетельствует о взаимосвязи между локальным воспалением и развитием бесплодия при эндометриозе [6, 7]. В то же время у пациенток с эндометриозом было отмечено наличие маркеров не только локального, но и системного воспаления [8]. Но до сих пор при эндометриозе остается мало изученным функциональное состояние фагоцитов периферической крови, которые являются основными эффекторными клетками воспалительной реакции.

Как известно, триггерами воспаления чаще всего являются бактериальные эндотоксины, взаимодействие которых с паттерн-распознающими рецепторами (PRR) фагоцитов запускает в клетке синтез и секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов, индуцируя таким образом развитие воспалительной реакции [9]. В настоящее время нет единого мнения о роли инфекционного фактора в развитии эндометриоза. Были получены экспериментальные данные о том, что у макак с эндометриозом изменен состав кишечной микрофлоры, при этом значительно снижена концентрация лактобактерий, но повышено количество грамотрицательных бактерий [10]. При культивировании менструальной крови пациенток с эндометриозом выявлено усиленное образование колоний Escherichia coli, а в самой менструальной крови и в перитонеальной жидкости обнаружено повышенное содержание бактериального эндотоксина [11]. В содержимом овариальных эндометриоидных кист были выявлены признаки субклинического инфицирования и установлено присутствие стрептококков, стафилококков и энтеробактерий [12]. Проспективное национальное когортное исследование на Тайване [13], в котором участвовали 79 512 пациенток, показало, что среди пациенток с воспалительными заболеваниями цервикса, вагины или вульвы число женщин с эндометриозом было достоверно больше, чем в контрольной группе, при этом наличие инфекций генитального тракта в 2 раза повышало риск развития эндометриоза. Однако прямых доказательств участия инфекционных агентов в активации клеток фагоцитарного ряда при эндометриозе и связанном с ним бесплодии в проведенных исследованиях получено не было.

Цель настоящего исследования — выявление особенностей экспрессии специфических паттерн-распознающих рецепторов, а также костимулирующих молекул^​*​ фагоцитарными клетками периферической крови у пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием, а также оценка взаимосвязи активности системных реакций врожденного иммунитета и наличия маркеров бактериально-вирусной инфекции при эндометриозе и связанном с ним бесплодии.

Исследование проводилось на базе эндоскопического отделения ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова». Всего были обследованы 178 пациенток, поступивших на оперативное лечение по поводу бесплодия. Всем пациенткам была произведена лапароскопия с деструкцией очагов эндометриоза. В ходе лапароскопии у 115 женщин был диагностирован эндометриоз I—II стадии (основная группа), у 63 женщин — эндометриоз III—IV стадии по классификации ASF (группа сравнения). Контрольную группу составили 33 практически здоровые фертильные женщины, которые не имели гинекологической патологии на момент обследования и поступили на хирургическую стерилизацию по социальным показаниям.

Обследование проводилось однократно при поступлении в стационар. Материалом для исследования служила гепаринизированная периферическая венозная кровь. Выделение популяций мононуклеарных клеток (МНК) и нейтрофилов из крови проводили с использованием стандартной процедуры центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078 и d=1,114). Экспрессию паттерн-распознающих рецепторов TLR2, CD36, CD204 и костимуляторных молекул CD86 на мембранах моноцитов и нейтрофилов оценивали с помощью моноклональных антител (мАТ) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScanto II. В исследовании использовали следующие мАТ: конъюгированные с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) анти-TLR2- и анти-CD36-антитела, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ) анти-CD204-, анти-CD86- и анти-CD14-антитела. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Анализ результатов проводили в программе FACSDiva. Анализировали клетки в моноцитарном и нейтрофильном гейтах, которые устанавливали на точечных графиках распределения событий в координатах FSC/SSC. Кроме того, в сыворотке крови определяли наличие антител (IgM, IgA, IgG) к возбудителям бактериально-вирусных инфекций (ВПГ, ЦМВ, вирусу Эпштейна—Барр (ВЭБ), Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Toxoplasma gondii) методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем производства «Вектор-Бест».

Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Проверка рядов на нормальность распределения выявила, что распределение полученных значений подчинялось нормальному, поэтому статистический анализ данных осуществлялся по общепринятым методам вариационной статистики с оценкой достоверности различий между показателями независимых выборок по t-критерию Стъюдента.

Возраст обследованных пациенток колебался от 24 до 36 лет и не различался в группах. Репродуктивная функция была реализована у 100% женщин контрольной группы. Роды в анамнезе были у 18% женщин с эндометриозом I—II стадии и у 15% пациенток с эндометриозом III—IV стадии (р>0,05). У всех пациенток с эндометриозом на момент обследования было диагностировано бесплодие, при этом первичное бесплодие отмечалось у 55,5% женщин с эндометриозом I—II стадии и у 69% женщин с эндометриозом III—IV стадии (р>0,05). Вторичное бесплодие было отмечено в 44,5 и 31% наблюдений соответственно в группах (р>0,05). Оценка инфекционного статуса пациенток показала, что распространенность маркеров острой и хронической вирусной и бактериальной инфекции у женщин с эндометриозом III—IV стадии не отличалась от соответствующих показателей в контрольной группе. Только у пациенток с эндометриозом I—II стадии нами был выявлен ряд отличий. Так, в этой группе, по нашим данным, достоверно чаще, чем в контрольной группе, отмечалось наличие EA-IgG-антител к ВЭБ (65 и 28,5% соответственно; p<0,02) и IgA-антител к хламидии трахоматис (11% и 0 соответственно; p<0,01). Кроме того, у пациенток с эндометриозом I—II стадии чаще, чем при эндометриозе III—IV стадии, встречались IgA-антитела к Ureaplasma urealyticum (21,5% и 0 соответственно; p<0,001). Таким образом, у пациенток с малыми формами эндометриоза обнаруживалась повышенная частота выявления маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования, что отличало их как от контрольной группы, так и от группы пациенток с распространенными формами эндометриоза.

Для оценки уровня активации фагоцитов периферической крови при эндометриозе определяли экспрессию моноцитами и нейтрофилами PRR, относящимися к классу Toll-подобных рецепторов (TLR2-молекулы) и к классу «рецепторов-мусорщиков» — (SR-A (CD204) молекулы и SR-B (CD36) молекулы. Кроме того, оценивали экспрессию фагоцитами молекул CD86, относящихся к семейству B7-молекул и выполняющих костимуляторные функции, участвуя в проведении активирующего сигнала от фагоцитов к лимфоцитам и способствуя, таким образом, активации реакций адаптивного иммунитета [14]. Анализ данных показал, что у женщин с эндометриозом как I—II, так и III—IV стадий было достоверно снижено по сравнению с показателями в контрольной группе содержание моноцитов CD36+ и CD204+ (p=0,000 во всех случаях) и нейтрофилов CD204+ (р=0,05 и р=0,025 соответственно) (см. таблицу). Достоверных различий между группами пациенток с эндометриозом различной степени тяжести при этом мы не выявили. Отличительной характеристикой пациенток с малыми формами эндометриоза было высокое содержание моноцитов TLR2+ и нейтрофилов CD86+, которое превышало аналогичные показатели как в контрольной группе (p=0,040 и р=0,001 соответственно), так и в группе с эндометриозом III—IV стадии (р=0,005; р=0,046, соответственно).

Таким образом, у всех пациенток с эндометриозом вне зависимости от степени его тяжести было выявлено угнетение экспрессии «рецепторов-мусорщиков» фагоцитами крови. Причем снижение экспрессии молекул CD36 было выявлено только в популяции моноцитов, тогда как угнетение экспрессии молекул CD204 отмечалось как в популяции моноцитов, так и в популяции нейтрофилов. Изначально этот класс рецепторов фагоцитов был идентифицирован на основании их способности связывать модифицированные липопротеины низкой плотности, что свидетельствовало об участии этих молекул в развитии атеросклероза [15]. Дальнейшие исследования показали, что «рецепторы-мусорщики» вовлекаются также в развитие воспалительных реакций, в регуляцию иммунного ответа при различных хронических заболеваниях, сахарном диабете и канцерогенезе [15]. По данным литературы [15], лигандами^​*​ молекул CD36, относящихся к классу В «рецепторов-мусорщиков», являются тромбоспондин-1, жирные кислоты, модифицированные липидные частицы, апоптотические клетки, бактериальные и грибковые агенты. Молекулы CD204, относящиеся к A классу «рецепторов-мусорщиков», участвуют в распознавании фагоцитами липопротеинов низкой плотности, апоптотических клеток, β-амилоидного пептида, фосфолипидов [15]. Эти рецепторы вовлекаются также в развитие как адаптивного, так и врожденного иммунного ответа вследствие распознавания различных грамотрицательных и грамположительных патогенных агентов [18]. Основной функцией «рецепторов-мусорщиков» является удаление клеточных остатков и погибающих клеток. Ранее мы выявили сниженную экспрессию молекул CD36 и CD204 перитонеальными макрофагами пациенток с эндометриозом [16]. При этом в эксперименте in vitro было установлено, что сниженная экспрессия «рецепторов-мусорщиков» приводит к нарушению ответа перитонеальных макрофагов пациенток с эндометриозом на стимуляцию клетками эутопического эндометрия [16]. Эти данные позволили предположить, что низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» перитонеальными макрофагами может приводить к угнетению своевременного клиренса макрофагами эндометриальных клеток из перитонеальной полости, способствуя, таким образом, формированию и росту очагов эндометриоза [16]. Поскольку перитонеальные макрофаги формируются из пула моноцитов крови, то, по-видимому, низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» макрофагами определяется изначально нарушенной экспрессией этих рецепторов моноцитами. Таким образом, выявленное нами угнетение экспрессии молекул CD36 и CD204 моноцитами пациенток с эндометриозом различной степени тяжести можно рассматривать в качестве одного из факторов, ассоциированных с иммунными механизмами развития эндометриоидных гетеротопий.

Ряд иммунологических изменений был отмечен нами только у пациенток с бесплодием и эндометриозом I—II стадии. Для них было характерно высокое содержание моноцитов TLR2+ и нейтрофилов CD86+, что свидетельствует о более выраженном проявлении системного воспаления в этой клинической группе. Высокий уровень TLR2-позитивных моноцитов можно связать c выявленной нами повышенной распространенностью маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования у пациенток данной клинической группы. Как известно, TLRs вовлекаются в ответ на различные экзогенные патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (РАМР), а также отвечают на широкий спектр эндогенных молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP) [9]. Рядом исследователей было высказано предположение, что инфекционный фактор можно рассматривать в качестве триггера эндометриоза, поскольку первоначальная активация PRR различными микробными агентами приводит к активации врожденного иммунитета и развитию воспаления. DAMP-опосредованные сигналы, такие, например, как усиленное поступление железа при ретроградной менструации, лежат, по мнению этих авторов [9], в основе развития второй волны стерильного воспаления, способствующего прогрессии эндометриоза. Выявленное нами высокое содержание моноцитов TLR2+ при эндометриозе I—II стадии и повышение распространенности в этой группе маркеров острого вирусного и бактериального инфицирования хорошо согласуется с гипотезой о роли инфекционного фактора как триггера эндометриоза. В то же время усиление экспрессии молекул TLR2 в ответ на инфекционный стимул может быть связано с развитием бесплодия у пациенток с эндометриозом I—II стадии. Известно, что инфекционный фактор является одной из важных причин нарушения фертильности, а активированные фагоциты продуцируют различные провоспалительные цитокины, способные оказывать негативное влияние на репродуктивную функцию женщин.

Для уточнения взаимосвязи между иммунными нарушениями и инфицированием пациенток с эндометриозом I—II стадии и бесплодием был проведен дифференцированный анализ иммунологических показателей у женщин в зависимости от наличия или отсутствия у них маркеров острого вирусного инфицирования (IgM-антител к ВПГ, ЦМВ и ВЭБ), острого бактериального инфицирования (IgA антител к Ch. trachomatis, Ureaplasma urealyticum, M. hominis) и хронического бактериального инфицирования (IgG антител к вышеперечисленным бактериальным инфекциям). Проведенный анализ не выявил различий в экспрессии «рецепторов-мусорщиков» у пациенток в зависимости от наличия или отсутствия маркеров инфицирования. У пациенток этой группы отмечался стабильно низкий уровень экспрессии этих рецепторов, что еще раз подтверждает наше предположение о вовлечении рецепторов в механизмы развития эндометриоза, а не связанного с ним бесплодия. Однако ряд показателей различался в подгруппах с инфекцией и без нее. Так, содержание нейтрофилов TLR2+ у пациенток с эндометриозом I—II стадии, имеющих маркеры острой вирусной инфекции, было достоверно выше аналогичного показателя в подгруппе без маркеров вирусного инфицирования (78,70±1,61 и 72,58±1,72% соответственно; р=0,011). Таким образом, экспрессия молекул TLR2 при малых формах эндометриоза зависит от наличия инфекционного фактора, в частности, от наличия маркеров вирусной инфекции. По нашим данным, только у пациенток этой группы достоверно более часто выявлялись антитела IgG к раннему антигену вируса Эпштейна—Барр (EA-IgG). Как известно, наличие этих антител свидетельствует об активной фазе ВЭБ-инфекции, так как EA-IgG обнаруживаются в крови в сроки от нескольких недель до года после инфицирования; кроме того, концентрация этих антител быстро увеличивается при реактивации инфекции [17]. Поэтому ВЭБ-инфекция может быть одним из факторов, которые, с одной стороны, активируют фагоцитоз крови, а с другой, способствуют развитию бесплодия у пациенток с эндометриозом I—II стадии. Негативная роль вирусов герпетической группы, в которую входит ВЭБ, в нарушении различных этапов репродуктивных процессов в настоящее время считается полностью доказанной [18, 19].

Нами также была выявлена зависимость между экспрессией молекул CD86 моноцитами и наличием маркеров вирусного и бактериального инфицирования. Так, содержание моноцитов CD86+ у пациенток с эндометриозом I—II стадии, имеющих в крови маркеры острого вирусного инфицирования и хронической бактериальной инфекции, было достоверно повышено по сравнению с таковым у пациенток без этих маркеров (см. рисунок). При этом в подгруппах женщин с маркерами острой бактериальной инфекции и без нее достоверных различий в содержании CD86+ моноцитов мы не выявили. Как известно, костимулирующие молекулы CD86 взаимодействуют со своим лигандом CD28 на поверхности лимфоцитов, активируя, таким образом, реакции адаптивного иммунитета и индуцируя развитие преимущественно Th2-типа иммунного ответа [20]. Таким образом, вирусное и бактериальное инфицирование, по-видимому, не только вызывает усиленную активацию моноцитов у пациенток с эндометриозом I—II стадии, но и гуморальный иммунный ответ и усиленную выработку антител. Несбалансированная активация гуморальных реакций в свою очередь может быть причиной выработки аутоантител, которые выявляются у пациенток с эндометриозом I—II стадии и, предположительно, участвуют в развитии бесплодия [21].

1. Экспрессия паттерн-распознающих рецепторов TLR2, SR-А, SR-B и костимулирующих молекул фагоцитами крови изменяется при эндометриозе I—II стадии, и эти изменения могут быть связаны как с иммунными нарушениями, участвующими в развитии эндометриоидных очагов, так и с особенностями инфицирования пациенток.

2. Низкий уровень экспрессии «рецепторов-мусорщиков» SR-A (CD204) и SR-B (CD36), отмечаемый при эндометриозе различной степени тяжести, вероятно, в большей степени ассоциирован с иммунными механизмами развития эндометриоза. Так как «рецепторы-мусорщики» участвуют в удалении клеточных остатков, то низкий уровень их экспрессии на моноцитах может приводить к формированию неполноценного пула перитонеальных макрофагов, образующихся из циркулирующих моноцитов. В свою очередь неспособность перитонеальных макрофагов своевременно элиминировать из перитонеальной полости остатки клеток, в том числе фрагменты эндометрия во время менструации, является одним из важных факторов, способствующих формированию эндометриоидных очагов.

3. Особенности экспрессии ряда таких рецепторов, как молекулы CD86 и TLR2, по нашим данным, в большей степени связаны с инфекционным статусом пациенток и могут определяться повышенной частотой острого вирусного и хронического бактериального инфицирования при эндометриозе I—II стадии. Предположительно нарушения экспрессии CD86 и TLR2 ассоциированы с развитием бесплодия при малых формах эндометриоза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.