Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костной и хрящевой ткани является проблемным, поскольку большие дефекты не могут спонтанно заживать. Использование стволовых клеток изучают регенеративная биология и регенеративная медицина. Развитие этих разделов науки позволяет надеяться на успешность терапевтического лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами [2, 4, 5].

Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезенхимальные стволовые клетки — МСК), способные к дифференцировке в кость, хрящ, сухожилия и другие виды соединительной ткани, благодаря чему их широко применяют для ускорения регенерации костной ткани [2, 6, 7, 9].

Использование МСК приводит к ускорению регенерации поврежденных костей, увеличению их плотности по сравнению с таковой при естественном течении репаративных процессов [3, 10, 11, 15].

Нами в эксперименте изучены процессы регенерации участка повреждения кости нижней челюсти крыс в разные сроки после введения суспензии аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККМП) в культуральной среде.

В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180—200 г в возрасте 6 мес. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». На каждую точку исследования было использовано не менее 10 животных.

Модель дефекта костной ткани [1, 12] и применения АМСККМП в эксперименте. Под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной, при соблюдении правил асептики и антисептики после обработки кожи спиртом скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5—2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором делали круглое отверстие диаметром 2 мм в кости угла нижней челюсти, с полостью рта дефект кости не сообщался. Затем послойно ушивали рану викрилом.

Животные были разделены на 2 группы в зависимости от хода регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти: 1-я группа — естественное течение репаративного процесса (70 крыс); 2-я группа — репарация на фоне введения в искусственный дефект нижней челюсти 100 мкл суспензии АМСККМП в культуральной среде (1·106 клеток/мл) — 70 животных.

АМСККМП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей у крыс-самцов линии Wag. Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 ч после эксплантации костного мозга культуральную среду с неприкрепившимися клетками сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде α-МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37 °С в СО₂-инкубаторе с 5% СО₂ в условиях насыщенной влажности. Смену среды производили каждые 3 дня. При субкультивировании монослойную культуру рассевали в плотности 1000—5000 клеток/см² (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), используя стандартные растворы Версена и трипсина.

Методами световой и флюоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было показано, что культивируемые клетки костного мозга крысы:

— были CD⁹⁰⁺, CD¹⁰⁵⁺, CD^34–, CD^45–;

— in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования;

— имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли на протяжении всего времени культивирования;

— поддерживались в культуре в течение нескольких пересевов;

— формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности;

— в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клетки костной ткани.

Для исследования использовали клетки 2—3 пассажей.

Однако физические, морфологические и фенотипические признаки также не являются критериями, которые могут быть использованы для специфической идентификации АМСККМП. Способность АМСККМП к индуцированной дифференцировке in vitro в кости, жир и хрящ является единственным критическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.

Индукция остеогенной дифференцировки МСК in vitro. Поскольку АМСККМП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифференцирования обычно используется для характеристики культур стволовых клеток invitro и является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АМСККМП в культуре. Для индукции остеогенной дифференцировки использовали 0,1 µM дезоксиметазон, 50 µM аскорбиновую кислоту и 10 mM β-глицерофосфат («Sigma», США).

Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по активности щелочной фосфатазы (ЩФ) и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление ЩФ проводили с использованием нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата ЩФ 5-бромо-4-хлоро-3-индолила. Накопление кальция в межклеточном матриксе регистрировали по окрашиванию ализарином красным.

Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 4 и 5 нед после операции. Участок нижней челюсти с искусственно созданным дефектом фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч.

При оценке результатов методом рентгеновской денситометрии использовали фиксированные и препарированные фрагменты нижней челюсти крыс с удаленной кожей и подкожной клетчаткой. В компьютере радиовизиографа (Россия, 2004) была установлена программа для исследования плотности костной ткани, которую выражали в условных единицах (отношение плотности кости в участке повреждения к таковой в аналогичных неповрежденных участках на контралатеральной стороне). Статистическую обработку результатов проводили с применением прикладной статистической программы MS Excel («Microsoft», USA), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Различия между средними считали достоверными при p<0,05.

Далее фрагменты нижней челюсти декальцинировали в растворе Биодек R («Bio Optica Milano», Италия) в течение суток, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Романовскому и изучали при увеличении светового микроскопа Axioimager M1 («Zeiss», Германия) до 1200 раз.

Через 1 нед после повреждения кости нижней челюсти при спонтанной регенерации отверстие частично заполнялось кровью, на некоторых участках в дефекте кости уже присутствовали фрагменты рыхлой волокнистой соединительной ткани и грануляции. Следует отметить начало образования кости в дефекте (формирование отдельных островков молодой кости и хряща среди грануляций). Кроме того, обнаруживались нежизнеспособные фрагменты костной ткани, образовавшиеся, скорее всего, при создании дефекта (опилки). Вокруг этих фрагментов располагались макрофаги и многоядерные клетки, видимо, остеокласты или гигантские клетки инородных тел, сформированные для лизиса крупных фрагментов нежизнеспособных тканей.

Через 2 нед после создания дефекта кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто молодой костной тканью с большим числом полнокровных кровеносных сосудов по краю дефекта. Среди вновь образованных структур часто присутствовала хрящевая ткань, особенно в центре искусственного отверстия.

На 3-й неделе после повреждения кости нижней челюсти отверстие было полностью закрыто вновь образованной костной тканью. О месте операции можно было судить по оставшимся крупным сосудам и хаотично расположенным костным балкам (костная мозоль). Иногда кость в дефекте практически не отличалась от окружающей ткани, однако расположенные в некоторых участках структуры костной мозоли позволяли найти место хирургического вмешательства (см. рисунок, 1, а, б на цв. вклейке).

Через 4 нед в большинстве случаев самостоятельного заживления только по следам костной мозоли можно было найти место операции. К этому моменту появились полностью сформированные полости с костным мозгом. В 1 наблюдении практически все отверстие кости представляло собой полость, заполненную красным костным мозгом, где присутствовало много крупных полнокровных кровеносных сосудов. Спустя 5 нед у животных этой группы отверстие было полностью закрыто костной тканью со следами образования костной мозоли.

На фоне введения АМСККМП в культуральной среде спустя 1 нед дефект кости был полностью заполнен кровью, между кровяным сгустком и краем дефекта определялись типичные грануляции. Необходимо отметить начало образования кости в дефекте (формирование отдельных островков молодой кости и хряща среди грануляций), т.е. состояние тканей в дефекте кости в этот срок практически соответствовало таковому в контроле, однако в структурах, заполняющих отверстие в кости, в том числе и в грануляциях, было значительно больше кровеносных сосудов.

На 2-й неделе после введения АМСККМП отверстие в кости нижней челюсти было полностью замещено молодой костной и хрящевой тканью (множество слившихся островков) с большим содержанием полнокровных тонкостенных кровеносных сосудов. Необходимо отметить формирование структур красного костного мозга уже в этот срок. На некоторых участках можно было найти отдельные небольшие фрагменты соединительной ткани разных типов с крупными тонкостенными кровеносными сосудами и большими многоядерными клетками, скорее всего, мегакариоцитами, что является одним из признаков развития красного костного мозга. То есть к этому времени наблюдалось резкое ускорение процессов, приведшее к быстрому развитию или регенерации в костной мозоли гемопоэтической структуры — костного мозга (см. рисунок, в, г).

Через 3 нед после введения АМСККМП в культуральной среде дефект кости был полностью замещен слившимися островками молодой костной ткани также со структурами красного костного мозга между ними.

В сроки 4 и 5 нед после введения АМСККМП в культуральной среде в большинстве случаев отверстие в кости было полностью закрыто костной мозолью с полностью сформировавшимися структурами красного костного мозга между АМСККМП.

После статистической обработки данных денситометрии процессов регенерации дефекта кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении и после применения АМСККМП было обнаружено отсутствие достоверных различий в плотности костной ткани и дефекте у животных сравниваемых групп на каждую точку исследования. Однако плотность костной ткани и при естественном ходе репаративных процессов, и на фоне использования АМСККМП была статистически значимо меньше плотности здоровой кости: на 2-й неделе — на 11 и 10,7% соответственно, а через 5 нед — на 9,5 и 16,8%. То есть плотность костной ткани на участке повреждения в эти сроки была такой же, как спустя 1 нед после операции или даже меньше (см. рисунок, д, е, см. таблицу).

Кроме того, необходимо отметить, что на 4-й и 5-й неделях наблюдения плотность костной ткани на участке повреждения после применения АМСККМП была несколько меньше, чем при спонтанном заживлении, причем спустя 5 нед эти различия были более выраженными (см. рисунок, д, е, см. таблицу).

На фоне введения АМСККМП в культуральной среде спустя 1 нед состояние костной ткани в дефекте практически соответствовало таковой в контроле, однако в структурах, заполняющих отверстие в кости, в том числе и в грануляциях, было значительно больше число кровеносных сосудов.

На 2-й неделе после введения АМСККМП уже отмечалось формирование красного костного мозга, т.е. к этому времени наблюдалось резкое ускорение процессов, приведшее к быстрому развитию или регенерации в костной мозоли гемопоэтической структуры — костного мозга.

В последующие сроки происходили дальнейшее слияние островков костной ткани с формированием костной мозоли и прогрессирующее восстановление красного костного мозга.

Согласно данным литературы, МСК формируют строму костного мозга, а гемопоэтические стволовые клетки участвуют в регенерации красного костного мозга. Поэтому при введении только гемопоэтических клеток в разные участки тела костный мозг не образуется [13]. Однако в последнее время появились данные о возможности трансдифференцировки гематопоэтических клеток костного мозга в тканеспецифичные стволовые клетки и обратно [14].

Введение грызунам суспензии МСК и деминерализованного костного матрикса в пустую костномозговую полость трубчатой кости привело к образованию трабекул и стромы, поддерживающей гематопоэз [8]. После применения графта из композиции гидроксиапатита и коллагенового геля с МСК для замещения средней трети бедренной кости у кроликов, кроме новой костной ткани с постепенной биодеградацией искусственного материала, были найдены структуры костного мозга [3].

Так как в данном эксперименте были использованы МСК костномозгового происхождения, не исключено присутствие среди них небольшого числа гемопоэтических клеток. Видимо, действием этих клеточных элементов и объясняется быстрая и ранняя регенерация гемопоэтической структуры — красного костного мозга. Необходимо отметить возможность трансдифференцировки АМСККМП в гемопоэтические стволовые клетки [14].

Денситометрия дефекта кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении и после применения АМСККМП выявила, что через 2 и 5 нед после операции плотность костной ткани статистически значимо отличалась от плотности здоровой кости. При этом спустя 4 и 5 нед после операции плотность кости в дефекте на фоне применения АМСККМП была меньше, чем при естественном ходе репаративного процесса.

Исходя из данных литературы [3, 10, 11, 15], мы ожидали ускорения регенерации поврежденной кости и соответственно большей ее плотности, чем это оказалось по результатам денситометрии челюсти при естественном течении репаративных процессов.

Скорее всего, падение плотности кости в дефекте, по данным денситометрии на 2-й и 5-й неделях после операции, в обеих группах связано с развитием красного костного мозга. На 1-й неделе происходит активное развитие кости и повышение ее плотности, далее формируется красный костный мозг, который расположен в полостях, и соответственно плотность костной ткани падает. После введения АМСККМП костный мозг образуется быстрее и более выраженно, поэтому более существенно уменьшается плотность костной ткани на участке повреждения и становится даже ниже, чем при заживлении без использования клеток. Однако следует учитывать возможность снижения прочностных свойств восстановленной кости из-за присутствия больших полостей, заполненных костным мозгом.

Таким образом, основные особенности регенерации участка повреждения кости нижней челюсти крыс в условиях введения АМСККМП заключаются в значительно более раннем появлении структур красного костного мозга в формирующейся костной мозоли. Эти изменения прогрессируют в течение всего времени наблюдения и являются свидетельством ускоренного развития репаративных процессов.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (проект №21.31 «Разработка технологий управления процессами регенерации костных тканей с применением биодеградируемых полимеров»).

Вышеизложенное позволяет заключить, что после применения АМСККМП в костной мозоли значительно раньше формируются структуры красного костного мозга, чем при естественном ходе регенерации. Образование полостей с костным мозгом приводит к тому, что на 4-й и 5-й неделях наблюдения плотность костной ткани на участке повреждения после применения АМСККМП меньше, чем при спонтанном заживлении. Указанные изменения прогрессируют в течение всего времени наблюдения и являются свидетельством ускоренного развития репаративных процессов. Однако возможно снижение прочностных свойств восстановленной кости из-за присутствия больших полостей, заполненных костным мозгом.