Традиционно в качестве лечения пульпита у взрослых пациентов применяется экстирпация — полное удаление пульпы с последующей обработкой и пломбировкой пульпарной камеры и корневых каналов. Подобным образом поступают и при случайном вскрытии пульпы или сколе зуба, нарушающем целостность пульпарной камеры. При пульпотомии происходит удаление всех клеток пульпы, включая одонтобласты, участвующие в формировании дентина, что приводит к повышению хрупкости зуба, нарушению его интеграции с окружающими тканями и в результате — к его полной утрате [14]. Восстановление жизнеспособной ткани пульпы зуба при нарушении целостности пульпарной камеры в отсутствие воспалительных процессов является важной клинической задачей, позволяющей сохранить зуб и избежать затратной и не всегда эффективной установки имплантатов. Для регенерации соединительной ткани пульпы могут быть использованы стволовые клетки, извлеченные из пульпы выпавших или удаленных зубов самого пациента или доноров (аллогенные).

В настоящее время выделены и подробно охарактеризованы культуры стромальных мезенхимальных клеток (МСК) из пульпы молочных и коренных зубов — описан их иммунофенотип, исследованы пролиферативная активность и дифференцировочный потенциал [6, 13]. Показано, что, как и МСК из других источников, клетки пульпы способны к дифференцировкам в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлении. Но помимо этих потенций, МСК пульпы способны также к нейрональной дифференцировке, что определяется происхождением данных клеток из эктомезенхимы — производной нейрального гребня [6, 8]. Трансплантация данных клеток позволит обеспечить надлежащую иннервацию и создаст условия для формирования жизнеспособной рыхлой волокнистой соединительной ткани пульпы.

Показано, что клеточные культуры МСК, полученные из пульпы, могут быть криоконсервированы и храниться в течение длительного периода без снижения пролиферативного и дифференцировочного потенциала с целью отдаленного применения для регенерации [1, 4, 10]. Подход, основанный на использовании заранее банкированных клеток самого пациента или донорского материала, позволяет в кратчайшие сроки произвести трансплантацию, что существенно повышает эффективность лечения.

В ряде работ было показано, что подкожная трансплантация клеток пульпы, иммобилизованных на скаффолдах и помещенных во фрагмент депульпированного зуба, приводит к формированию внутри такой конструкции ткани, схожей по строению с соединительной тканью пульпы [3, 5, 12]. Кроме того, участие стволовых клеток в регенерации пульпы было показано непосредственно на модели пульпоэктомии у лабораторных животных [16, 17].

В настоящей работе проведено исследование регенерации ткани пульпы при трансплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток пульпы коренных зубов в составе фибринового сгустка в пульпарную камеру после пульпоэктомии у миниатюрных домашних свиней. Восстановление тканей пульпы зуба при нарушении целостности пульпарной камеры в отсутствие воспалительных процессов является перспективным направлением использования клеточных технологий.

Для получения культуры мультипотентных стромальных клеток (МСК) пульпы зуба у карликовых домашних свиней удаляли зуб под общей анестезией (золетил 15 мг/кг/рометар 2 мг/кг), исключали очаги воспаления и доставляли в лабораторию во флаконе с транспортной средой: F-12 («ПанЭко», РФ), 500 мкг/л амикацина (ОАО «Синтез», РФ), 10 Ед/мл гепарина натрия («Braun», Германия) при температуре 2—8 °С. Зуб обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата (ООО «Росбио», РФ), раскалывали и извлекали пульпу. Ткани промывали раствором Хэнкса с добавлением 0,5 г/л цефазолина (ОАО «Синтез», РФ) (рис. 1),

Клетки имели характерный для мультипотентных стромальных клеток фенотип — вытянутую или полигональную форму, ядро с 2—3 ядрышками, небольшой размер (5—10 мкм) (см. рис. 1).

Для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma, PRP), кровь миниатюрных свиней собирали в пробирки с ЭДТА, центрифугировали при 1100 об/мин в течение 10 мин. Тромбоциты, содержащиеся в супернатанте, осаждали центрифугированием при 3600 об/мин в течение 15 мин и ресуспензировали в половине объема супернатанта.

МСК снимали с чашек Петри раствором Версена с добавлением 0,25% раствора трипсина и центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин. Осадок ресуспензировали в обогащенной тромбоцитами плазме крови с получением клеточной суспензии с концентрацией клеток 4 млн в 1 мл плазмы. Для образования фибрина из содержащегося в PRP фибриногена в систему добавляли по каплям тромбин («Cormay»), растворенный в 10% растворе хлорида кальция («ДальХимФарм»). Полимеризация происходила в течение 3—5 мин.

Эксперимент проводился на 3 миниатюрных свиньях светлогорской популяции на базе Научного центра биомедицинских технологий РАМН. У животных экспериментальной группы (3 свиньи, 18 моляров) моделировали случайное вскрытие пульпы с пульпотомией. Под общей анестезией (золетил 15 мг/кг/рометар 2 мг/кг) алмазным шаровидным бором наносили повреждения на жевательной поверхности моляров. Повреждения были сделаны на глубину 5,5 мм и удаление коронковой пульпы — пульпотомия — осуществляли острым стерильным экскаватором. Орошение вскрытой корневой пульпы осуществляли антисептическим раствором хлоргексидином биглюконата 0,5%. Гемостаз после удаления пульпы из полости зуба и устьев каналов осуществляли на основе 20% сульфата железа. После полной остановки кровотечения проводили покрытие «культи» пульпы трансплантатом, полость закрывали пломбой FUJI IX (GC, Япония). Через 2 нед (1-е животное), 4 нед (2-е животное), 12 нед (3-е животное) свиньи подверглись эвтаназии путем передозировки внутривенно (раствором золетила 100 мг/кг) в соответствии с Приложением № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ № 755 от 12.08.77) и был проведен забор блоков челюстей.

Образцы фиксировали в 70% этаноле в течение 15 дней. Затем обезвоживали и заливали в метилметакрилат (Osteo-Bead, Sigma-Oldrich) по стандартной методике, рекомендованной производителем с последующей полимеризацией. Из полученных блоков изготавливались первичные срезы 100 мкм (Isomet 100), из которых готовились шлифы толщиной 40—50 мкм, которые окрашивали кислым фуксином и толуидиновым синим, а также небесным трихромом.

Окрашенные шлифы подвергали микроскопии и документировали с помощью микроскопа Axioplan («Carl Zeiss», Германия).

Через 14 сут после частичной резекции пульпы выявлено, что коронковая часть зуба имеет дефект, заполненный пломбировочным материалом, который также наблюдался на всех последующих сроках. Стенки дефекта ровные, ход канала с жевательной или передней поверхности коронки перпендикулярно к пульпарной камере. Пульпарная камера содержит обрывки волокнистых структур. Волокнистые структуры не содержали клеточных элементов уже на 14-е сутки и в последующем на 30-е и 60-е сутки клеточная популяция не восстанавливалась. Коронка зуба сохраняет целостность своей структуры в течение 30 сут, в последующем к 60-м суткам после повреждения наблюдались трещины и сколы. Пародонтальная щель несколько расширена уже к 14-м суткам и имеет тенденцию к неуклонному расширению в последующие сроки. Собственно, пародонт с повышенной клеточностью: соединительная ткань с большим количеством фибробластоподобных клеток среди волокнистого матрикса. Корни зуба и шейка зуба с очаговыми признаками остеокластической резорбции, чаще в области межкорневой щели. В некоторых случаях было выявлено разобщение прикрепления слизистой оболочки к шейке зуба с формированием узкой, едва заметной щели.

Через 14 сут после частичной резекции пульпы и трансплантации тканеинженерной конструкции, содержащей аутологичные клетки пульпы зуба, выявлено, что коронковая часть зуба имеет дефект, заполненный аморфным белесоватым веществом (пломбировочный материал). Стенки дефекта ровные, ход канала с жевательной или передней поверхности коронки перпендикулярно к пульпарной камере. Пульпарная камера содержит базофильную клеточную структуру — клеточный трансплантат. Устья каналов корней со стороны пульпарной камеры по внутренней поверхности содержат участки с ячеистой структурой, часто богатой сосудами и высокой клеточностью. Указанные структуры напоминают по своему виду грануляционную ткань. Между сосудами нежный рыхлый волокнистый матрикс, который достигал 2/3 объема к 60-м суткам наблюдения. К этому времени на стенках пульпарной камеры заметны отложения дентина в области дна и боковых стенок. А также на поверхности под трансплантатом в виде дентинового мостика. Коронка зуба сохраняет целостность своей структуры на протяжении всех сроков наблюдения. Пародонтальная щель несколько расширена уже к 14-м суткам, однако без значимой прогрессии в течение остального времени наблюдения. Собственно, пародонт с повышенной клеточностью: соединительная ткань с большим количеством фибробластоподобных клеток среди волокнистого матрикса.

В настоящем исследовании было показано, что при трансплантации МСК пульпы в составе фибринового геля в область дефекта пульпы у миниатюрных домашних свиней уже через 14 сут наблюдается формирование рыхлой волокнистой соединительной ткани, в которой формируются дентиновые мостики, что свидетельствует о созревании функционально активных одонтобластов в области регенерации. Эффективность регенерации пульпы при использовании клеточных технологий зависит от возможности скорейшей трансплантации клеток в область дефекта после нарушения целостности пульпарной камеры. Для обеспечения немедленного введения клетки должны быть заранее получены у пациента или донора и криоконсервированы. В целом ряде исследований было показано, что хранение в жидком азоте не влияет на иммунофенотип, пролиферативную активность и дифференцировочный потенциал клеточных культур из пульпы [1, 4, 10]. При этом могут быть заморожены не только культуры стволовых клеток, а также фрагменты интактной пульпы и целые зубы [7, 9, 10]. В настоящее время уже создано несколько банков для хранения биоматериала из пульпы и периодонтальных тканей. Перед трансплантацией клетки иммобилизовали в фибриновом геле, полученном из плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (PRP, platelet-rich plasma). Действие факторов роста, высвобождающихся при активации тромбоцитов, таких как PDGF, TGF-β, IGF-I, EGF, VEGF и др. направлено на стимуляцию ан-гиогенеза, хемотаксиса, митотической и метаболической активности клеток, участвующих в регенерации [2, 15].

Регенерация дентина при трансплантации стволовых клеток из выпавших молочных зубов была ранее уже показана в работе на миниатюрных свиньях [16]. Но в данном исследовании наряду с клеточной культурой использовали дополнительные индукторы — щелочную фосфатазу и бета-трикальцийфосфат, которые, несомненно, внесли свой вклад в регенеративный процесс, тогда как в настоящем исследовании регенерация наблюдалась и без дополнительных стимулирующих агентов.

Эффективность применения дентальных клеток пульпы в сочетании с PRP для регенерации ткани пульпы была исследована также на модели дефектов незрелых зубов у собак [17]. В данной группе было показано формирование дентиновых мостиков, что не наблюдалось при трансплантации кровяного сгустка, клеточной культуры или PRP. Однако, по заявлению авторов, образованная ткань имела остеоподобную структуру и располагалась непосредственно в верхушке каналов, а не в пульпарной камере, как в настоящем исследовании, и восстановления именно тканей пульпы показано не было.

Однако накопленный опыт позволяет приступить к проведению ограниченных клинических испытаний метода. Так исследования по оценке эффективности применения клеток из пульпы выпавших молочных зубов для регенерации тканей пульпы пациентов детского и подросткового возраста уже перешли в клиническую стадию и в 2017 г. закончены испытания метода регенерации пульпы после некроза и инфекции пульпы, основанные на применении аутологичных клеток. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT01814436. К сожалению, результаты данного исследования к настоящему времени не опубликованы.

Таким образом, трансплантация аутологичных клеток пульпы в сочетании с обогащенной тромбоцитами плазмой может стать перспективным направлением в изучении регенерации ткани пульпы при ее частичной резекции, как модели случайного вскрытия пульпарной камеры в клинической практике.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ N16−15−00298.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.