Потеря зубов в результате разных общесоматических заболеваний, заболеваний пародонта и тканей зубов, а также травм приводит к нарушению первичной обработки пищи и воспроизведения речи, ухудшает эстетический вид и в целом здоровье и качество жизни индивида. Сегодня, по данным ВОЗ, почти 150 млн людей имеют проблемы, связанные с потерей зубов. В России у людей старше 65 лет в среднем удалено 18 зубов, а 14% жителей являются полностью беззубыми. При этом у многих людей нет зубов уже к 30 годам. Повреждение эмали и кариес являются главными причинами заболеваний и потери зубов. В мире у 60—80% детей школьного возраста и почти у 100% взрослых наблюдаются кариес, множественные трещины и повреждения эмали. Повреждение эмали может быть также обусловлено наследственными заболеваниями, такими как несовершенный амелогенез.

Для компенсации утраченной эмали обычно используют композитные материалы (пломбы). Однако этот подход имеет ряд возможных осложнений. Во-первых, через 4—5 лет герметичность границы между пломбой и эмалью нарушается, что увеличивает риск развития вторичного кариеса и (или) выпадения пломбы. Во-вторых, при подготовке к пломбированию и удалении пораженной кариесом эмали снимается большое количество зубной ткани, что ослабляет коронку зуба и может привести к расколу зуба. В-третьих, во время удаления глубоких кариозных тканей зуба велик риск повреждения пульпарной камеры, что требует депульпации зуба. В-четвертых, частыми осложнениями при постановке пломб являются хронический пульпит, периодонтит и локализованный пародонтит. И наконец, в-пятых, пломбирование может нарушить важный физиологический баланс между твердостью и упругостью эмали и подлежащего дентина.

Недостатки современных методов лечения кариеса и повреждений эмали породили идею о выращивании биологических эквивалентов зубных тканей с помощью стволовых клеток. Данное направление получило название регенеративной стоматологии. При этом становится все более очевидным, что восстановить полноценную зубную ткань можно только с учетом законов естественного развития этой ткани.

В данном обзоре будут рассмотрены молекулярные и клеточные механизмы естественного формирования эмали зуба, а затем на основе понимания этих механизмов проанализирована возможность разработки технологии восстановления утраченной эмали с помощью роботической биопечати тканей in situ.

Эмаль уникальна. Это самая твердая ткань в организме человека. В отличие от других минерализованных тканей она не содержит клеток и состоит главным образом из кристаллов гидроксиапатита — ГА (75%), карбонатного апатита (12%) и небольшого количества белков, воды, липидов и углеводов. Предполагается, что способность живых организмов к биоминерализации некоторых своих тканей появилась более 500 млн лет назад [1]. После этого живые организмы стали использовать биоминерализацию для производства зубной эмали. Появление эмали увеличило эффективность жевания и откусывания пищи и обеспечило животным эволюционное преимущество, потому что зубы, покрытые эмалью, позволили потреблять ранее недоступные пищевые ресурсы, благодаря чему присутствие высших организмов на планете сильно расширилось.

Эмаль позволяет зубам выдерживать миллионы циклов нагрузок при откусывании и пережевывании пищи, а также защищает зуб от проникновения бактерий [2]. Эмаль производят высокоспециализированные клетки- амелобласты. Амелобласты секретируют белки, минерализация которых ГА приводит к образованию эмали [3]. Всю совокупность молекулярных и клеточных механизмов формирования эмали обозначают термином «амелогенез». Амелогенез начинается с дифференцировки клеток дентального эпителия в амелобласты.

Дифференцировку амелобластов инициируют реципрокные взаимодействия между дентальным эпителием и мезенхимой на стадии колпачка естественного одонтогенеза в ходе эмбрионального развития организма [4]. На этой стадии дентальный эпителий формирует 5 клеточных компартментов, необходимых для формирования эмали и других тканей зуба (рис. 1):

На стадии инициации эмалевый орган выделяет Wnt10A, который проникает через базальную мембрану и запускает дифференцировку мезенхимальных клеток в преодонтобласты. Преодонтобласты начинают секретировать коллаген 1-го типа, который отодвигает преодонтобласты от эпителия. Отступая, преодонтобласты оставляют отростки, из которых выделяются неколлагеновые белки, такие как дентинсиалофосфопротеин. Эти белки стимулируют минерализацию коллагена и образование дентина. При этом клеточные отростки остаются в дентине, формируя его тубулярную структуру.

На пресекреторной стадии базальная мембрана между эпителием и мезенхимой деградирует [5], что позволяет преодонтобластам контактировать c клетками внутреннего эмалевого эпителия и стимулировать их дифференцировку в преамелобласты [6].

На 3-й, секреторной, стадии преамелобласты окончательно дифференцируются в амелобласты. В этом процессе важную роль играют одонтобласты, Dlx3 (Distal-less homeobox 3) в преамелобластах и контакты преамелобластов с клетками прослойки. Так, было показано, что продуцируемые одонтобластами факторы роста — bone morphogenetic protein (ВМР) [7, 8] обеспечивают окончательное созревание преамелобластов, а фактор транскрипции Dlx3 в преамелобластах активирует экспрессию генов белков матрицы эмали, таких как энамелин и амелогенин [9]. Контакты преамелобластов с клетками прослойки, которые образуются в области десмосом благодаря молекулам адгезии Nectin-1 на амелобластах и Nectin-3 на клетках прослойки, также важны для созревания и секреторной активности амелобластов [10]. Предположение о важности этих контактов возникло после обнаружения у мышей с мутациями Nectin-1 и -3 выраженных дефектов эмали [10]. Кроме того, клетки прослойки продуцируют алкалин фосфатазу и Shh [11, 12], которые также вовлечены в созревание амелобластов. В целом 3-я стадия дифференцировки амелобластов знаменуется полным созреванием этих клеток и началом продукции на границе с дентином специфических белков, которые образуют матрицу эмали.

Амелобласты секретируют белки амелогенины, амелобластины, энамелины, тафтелины и амелотины, которые формируют белковую матрицу эмали [13]. При нарушении синтеза этих белков эмаль становиться хрупкой или не образуется совсем [14]. Другие белки, секретируемые амелобластами, например Са²⁺-связывающие фосфопротеины, обеспечивают прикрепление этих клеток к образующейся эмали [15].

Параллельно с формированием белковой матрицы происходит ее минерализация. В результате образуется эмаль и амелобласты отодвигаются от границы с дентином. События, происходящие в это время на одном из концов амелобласта, а именно выделение белков матрицы, выделение ферментов — инициаторов минерализации матрицы и сам процесс минерализации матрицы, были обозначены термином «процесс Томcа» (рис. 2)

Так, было показано, что в процессе синтеза белков и их минерализации волокна кристаллов ГА остаются прикрепленными к мембране амелобластов через специфические участки амелобластина и амелогенина [21, 22]. Установлено также, что белки матрицы секретируются в форме высокомолекулярных продуктов, которые расщепляются металломатричной протеазой (MMП)-20 [23]. Незначительную часть продуктов расщепления сразу поглощают амелобласты, и в результате освобождается место для формирования кристаллов. Другая часть продуктов расщепления — амелогенины с молекулярной массой не более 20 кДа приобретают способность связывать Ca²⁺ и PO₄^3– к остаткам глутаминовой кислоты, аспарагина и фосфосерила и формировать первичный кристаллит ГА кальция. И наконец, в экспериментах на нокаутных мышах было установлено, что удаление гена амелогенина сопровождается утратой способности амелобластов формировать призмы эмали, а образующаяся при этом апризматическая эмаль имеет толщину в 2 раза меньшую, чем у нормальной эмали [24]. Таким образом, амелогенин имеет критическое значение для формирования призм эмали.

Основная функция эмали состоит в том, чтобы обеспечить твердую поверхность зуба для эффективного откусывания и разжевывания пищи. Твердость эмали максимальна при 100% содержании апатита. Однако чистый апатит имеет твердость в 6 раз выше, чем у дентина [25]. Поэтому любая деформация зуба с эмалью из чистого апатита во время жевания вызовет повреждение подлежащего дентина. Природа предложила изящное решение этой проблемы — градиент твердости эмали [26]. Выяснилось, что в зубах твердость эмали уменьшается от окклюзионной поверхности по направлению к дентину от 6 ГПа, что соответствует твердости чистого апатита, до 2,5—3 ГПа, на границе с дентином [27—29] (рис. 3).

Кристаллы апатита, которые формируются в начале секреторной стадии дифференцировки амелобластов, имеют в поперечном сечении всего 2—3 нм. По мере движения амелобластов от границы с дентином волокна апатита растут в длину и к концу секреторной стадии их поперечное сечение увеличивается до 10 нм [16]. Такая первичная эмаль содержит много белка и уступает по твердости эмали взрослого зуба. Далее происходит вторичная минерализация эмали. Она связана с высвобождением протеазы, калликреина-4 (KLK-4) [30]. KLK-4 расщепляет белки матрицы, а амелобласты поглощают продукты расщепления. В результате содержание белка снижается почти в 100 раз, что делает возможным латеральный рост волокон апатита до 50 нм. Поскольку KLK-4 продуцируются амелобластами у поверхности эмали и затем диффундируют в толщу эмали, возникает градиент протеазной активности по направлению к дентину (см. рис. 3). Градиент протеазной активности формирует градиент белка [27, 31] и, соответственно, градиент свободного места для откладывания Г.А. Так появляется градиент твердости эмали. Биологическая целесообразность градиента твердости эмали очевидна — способствовать улучшению интеграции 2 разных по твердости тканей — эмали и дентина. На поверхности зуба, где происходят откусывание и пережевывание пищи, нужна твердая эмаль, а на границе с более мягким дентином — менее твердая, которая помогала бы дентину амортизировать нагрузки и не травмировала бы сам дентин.

Окончательная, третичная, минерализация эмали происходит после прорезывания зуба и появления коронки в полости рта. В это время амелобласты удаляются с помощью апоптоза. Основную часть неорганических веществ для продолжения минерализации эмали на этом этапе поставляет слюна. Механизмы третичной минерализации эмали и роль слюны в этих механизмах подробно проанализированы в монографии В.К. Леонтьева [32].

Колоссальная значимость кариозных и некариозных повреждений эмали в развитии серьезных заболеваний зубов [33, 34] породила большой спрос на развитие новых эффективных технологий восстановления эмали. Методы выращивания биологических аналогов ткани могли бы создать принципиально новые возможности для восстановления эмали. Однако эмаль человека формируется в течение нескольких десятков месяцев. Соответственно для технологий, которые воспроизводят естественное развитие ткани, также может потребоваться много месяцев. Такие сроки делают проблематичным использование методов выращивания эмали в качестве альтернативы использованию искусственных пломб.

Один из способов решения проблемы фактора времени мог бы состоять в том, чтобы «отпечатать» биологический эквивалент эмали с помощью 3D-биопринтера и затем перенести его на место повреждения. Однако при трансплантации биоинженерного конструкта возникнет проблема интеграции старой эмали с новой биоинженерной эмалью. Решить эту проблему можно было бы с помощью биопечати эмали непосредственно в место утраты этой ткани в зубе, т. е. in situ. В этом случае «зубное» микроокружение и амелобласты могли бы обеспечить «распечатываемую» эмаль нужными факторами и адгезивными молекулами, которые помогут интеграции старой и новой ткани.

Однако существующие биопринтеры имеют размеры, многократно превышающие размеры ротовой полости и поэтому не смогут «распечатать» эмаль на поврежденный зуб в челюсти пациента. Поэтому мы предложили к разработке принципиально новую для стоматологии технологию — технологию роботической 3D-биопечати эмали in situ. В этой технологии роботическая рука может внести в ротовую полость маленькую печатающую головку с форсунками для клеток и материалов и обеспечить точное расположение головки над зубом. После этого биопечатающая головка произведет прецизионную печать в зону дефекта эмали. Такая постановка задачи является уникальной, а ее решение может обеспечить России лидирующие позиции в области высокотехнологичной медицины.

Многое из того, что нужно сделать для разработки технологии роботической биопечати тканей зуба in situ, понятно уже сейчас. В 2015 г. французские разработчики запатентовали технологию нанесения ГА, клеток MG63 и мезенхимальных стволовых клеток на дефект костей черепа мыши in vivo. Мы рассматривали эту технологию как прототип для разработки нашей технологии. На рис. 4 представлен

Подготовка поврежденного участка эмали должна начинаться с надежной фиксации челюсти, в которой находится поврежденный зуб, и состоять из нескольких этапов: 1) выявление дефекта эмали с помощью маркеров, которые обозначат площадь и глубину дефекта; 2) сканирование поврежденной и отмеченной маркерами области и создание цифровой модели дефекта эмали; 3) удаление при необходимости части эмали, пораженной кариесом, и обработка образовавшейся полости вручную врачом-стоматологом или с помощью робота со специальным рабочим органом в соответствии с цифровой моделью дефекта эмали; 4) сканирование и создание цифровой 3D-модели дефекта эмали для использования в последующей биопечати новой эмали in situ.

Раскрытие механизмов естественного амелогенеза объясняет, какие клетки и на какой стадии дифференцировки надо использовать для биопечати эмали.

Учитывая важную роль одонтобластов в дифференцировке амелобластов и образовании эмали, как это ни парадоксально, становится очевидным, что проще «печатать» сразу 2 ткани — дентин и эмаль, чем только одну эмаль. Соответственно заболевания, такие как несовершенство амелогенеза, кариозные и эрозивные повреждения эмали, достигающие дентина, будут наиболее подходящими объектами для восстановления эмали с помощью биопечати in situ. Это означает, что для биопечати эмали нужно готовить 2 пула клеток: мезенхимальные стволовые клетки, которые можно дифференцировать до одонтобластов, и дентальные эпителиальные клетки, которые можно использовать для создания аналога первичного эмалевого узла и дифференцировать в амелобласты.

Аргументом в пользу использования одонтобластов при биофабрикации эмали являются данные, что одонтобласты продуцируют белки, которые участвуют в формировании матрицы эмали, например ММП-20 и тафтелин-интерактивный белок [35].

Устройство биопечати должно иметь, во-первых, несколько диспенсеров для нанесения разных типов клеток, ростовых факторов и других биоматериалов на область дефекта эмали, во-вторых, систему позиционирования биопечатающей головки и, в-третьих, устройство управления распределением клеток и биоматериала в соответствии с цифровой моделью дефекта эмали.

Задача биофабрикации эмали с помощью 3D-био-печати состоит в том, чтобы максимально воссоздать условия естественного амелогенеза для производства эмали. Понимание механизмов амелогенеза позволяет предложить варианты решения этой задачи.

1. Прежде всего необходимо решить, какую стадию амелогенеза целесообразно воспроизводить: начальную или более позднюю. При воспроизведении начальной стадии головка биопринтера должна на дне дефекта эмали, проникающего до дентина, распечатать слой мезенхимальных стволовых клеток, затем — базальную мембрану, над мембраной — 2 слоя эпителиальных клеток, имитирующих внутренний эмалевый эпителий и клетки прослойки, и сверху — сфероид эпителиальных клеток, имитирующий эмалевый узел (рис. 6).

2. При биопечати in situ важно обеспечить выживание клеток. Для выживания клеток необходимы питательные вещества и кислород. Питательные вещества могут содержаться в биочернилах, а кислород, вероятно, может поступать со стороны дентина.

3. Важной задачей биопечати является обеспечение быстрого, приемлемого для клиники, образования эмали. Добавление ростовых факторов, вероятно, поможет решить эту задачу. Среди таких факторов заслуживают внимание выделяемые эпителием WNT10А и Shh, выделяемые одонтобластами BMP и Dlx3 преамелобластов (см. выше).

4. Следующая задача биопечати состоит в том, чтобы обеспечить прикрепление образующейся новой эмали к старой эмали. Известно, что амелобласты прикрепляются к эмали с помощью адгезивных белков, выделяемых этими клетками, такими как кальцийсвязывающий фосфопротеин, обогащенный пролином и глутамином-1 [36]. Соответственно, можно ожидать, что амелобласты, используемые в биопечати, выделяя адгезивные белки, будут способствовать прикреплению новой эмали к существующей.

5. Важная задача биопечати эмали in situ состоит в том, чтобы создать условия для биоминерализации синтезируемой амелобластами белковой матрицы. В этом процессе важную роль играют белки-инициаторы, такие как алкалинфосфатаза. Эти белки выделяются амелобластами. Поэтому можно предположить, что при биопечати амелобластами эти клетки обеспечат инициирование минерализации [28]. Второй важный фактор минерализации — наличие Ca²⁺ и PO₄^3-. При естественном амелогенезе до прорезывания зуба эти ионы поступают из амелобластов, а после прорезывания — из слюны. Ввиду этого будет целесооб-разно добавлять в биочернила ионы Ca²⁺ и PO₄^3-.

6. И наконец, еще одна из видимых сегодня проблем — воспроизведение градиента твердости распечатываемой эмали. Можно надеяться, что при правильной процедуре амелобласты сами создадут нужный градиент. Кроме того, учитывая, что окклюзионный слой эмали состоит практически из чистого ГА, завершить биопечать можно печатью тонкого слоя безбелкового апатита с «пропечатыванием» бороздочек и бугорков зуба. При этом необходимо понять, как до формирования полноценной эмали защитить напечатанный клеточно-биоматериальный конструкт эмали от повреждений при жевании. Возможно, эту проблему можно будет решить с помощью постановки временной коронки.

Разработка технологии роботической биопечати эмали потребует создания нового вида роботических систем для решения следующих задач: 3D-сканирование зубной полости; компьютерная обработка полученной модели с целью определения дефектов зубной ткани (например, наличие кариозных зон, трещин и истончение эмали и др.); построение 3D-графической модели зубной полости и дефекта эмали; задание врачом алгоритма биопечати через дружелюбный интерфейс врач—робот; автоматическая генерация и выполнение программы движения роботом и мехатронным рабочим органом, осуществляющим биопечать; проектирование прецизионных аппаратно-программных устройств для нанесения клеток и материала в соответствии с цифровой моделью дефекта эмали; автоматизированный контроль качества результатов биопечати. Роботическая система должна также обеспечить безопасность пациента благодаря введению 3D-визуа-лизации операционной зоны и применению силовой системы очувствления робота.

Таким образом, технологии роботической 3D-био-печати эмали in situ могут обеспечить несколько серьезных преимуществ по сравнению с существующими методами лечения, а именно: 1) решат проблему герметичности границ между новой и старой эмалью и практически полностью снизят вероятность развития вторичного кариеса; 2) увеличат до пожизненного срок годности «биопломбы»; 3) благодаря минимальному удалению зубной ткани при устранении кариозного участка снизят вероятность раскола зуба и проникновения в пульпарную камеру; 4) снизят вероятность развития осложнений, которые могут возникать после пломбирования зубов искусственными материалами; 5) восстановят важный физиологический баланс между твердостью и упругостью эмали и подлежащего дентина, который трудно сохранить при использовании композитных материалов; 6) снизят негативное влияние «человеческого фактора» и др.

Не вызывает сомнения, что в следующем десятилетии регенеративная стоматология станет неотъемлемым компонентом лечения многих трудноизлечимых заболеваний зубов. Есть также основания полагать, что технологии роботической 3D-биопечати in situ позволят восстанавливать не только отдельные ткани зуба, но и весь зубной комплекс и в значительной степени заменят существующие методы протезирования зубов. Важно и то, что разработанные в технологии роботической 3D-биопечати зубных тканей in situ подходы могут помочь развитию технологий регенерации других тканей и органов и окажут влияние на всю регенеративную медицину.

Обзор написан при поддержке Министерства здравоохранения РФ (Государственное задание Министерства здравоохранения РФ от 02.02.16 № 056−00139−16, уникальный номер реестровой записи 110 401 000 000 000 000 071 021 02).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*Тел.: +7(985)177-9070