Долгое время «золотым стандартом» костно-пластического материала наряду с аутогенной костной тканью считается препарат Bio-Oss («Geistlich», Швейцария). В настоящее время он остается самым продаваемым костно-пластическим материалом в мире [1]. Однако в связи с общим падением импорта после 2014 г. в России существенно увеличился спрос на препараты отечественных производителей [2]. Тем не менее практикующие врачи по-прежнему сохраняют недоверие к таким материалам, потому что если в отношении Bio-Oss выполнено огромное количество независимых исследований in vitro и in vivo, то в отношении большинства отечественных препаратов исследований существенно меньше [3, 4].

Перспективным направлением является разработка активированных костно-пластических материалов. Они представляют собой композицию в виде «матрица-носитель + биологически активный компонент» [5]. В качестве матрицы-носителя, или скаффолда, для тканеинженерных конструкций нередко используют уже существующие костно-пластические материалы [6]. В качестве основного биоактивного компонента тканеинженерных конструкций или активированных клетками костно-пластических материалов часто используются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [7]. Главным требованием, предъявляемым к скаффолдам, является отсутствие цитотоксического воздействия на трансплантируемые клетки [8]. Костно-пластические материалы российского производства имеют все шансы стать препаратами выбора для проектирования активированных костно-пластических материалов после проведения дополнительных исследований на предмет цитосовместимости с ММСК из различных источников, обычно используемых для построения тканеинженерных конструкций.

Цель настоящего исследования — сравнение цитосовместимости используемых в стоматологии костно-пластических материалов различного происхождения с ММСК, полученными из пульпы выпавших молочных зубов и подкожного липоаспирата.

Для оценки цитосовместимости были отобраны материалы с наиболее популярным химическим составом на основе 1) ксеногенного гидроксиапатита (ГА) — Bio-Oss («Geistlich», Швейцария), Индост гранулы («Полистом», Россия), депротеинизированного костного матрикса — Биопласт («ВладМива», Россия); 2) коллагенового гидрогеля — Индост гель («Полистом», Россия), VISCOLL (Viscoll-PC-100, ИМТЕК, Россия); 3) β-трикальцийфосфа-та — Трикафор («Бионова», Россия), 4) коллагеновой губки — Индост губка («Полистом», Россия).

Для тестирования материалов использовали культуры ММСК, полученные из подкожной жировой клетчатки — AD-MSC (adipose tissue-derived mesenchymal stem cells) — и пульпы выпавших молочных зубов — SHED (stem cells from human exfoliated deciduous teeth). Культуры клеток были ранее получены и охарактеризованы в лаборатории генетики стволовых клеток ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (рис. 1).

МТТ-тест. Для изучения цитотоксического действия образцов материала использовали МТТ-тест — метод оценки количества живых клеток в пробе, основанный на способности сукцинатдегидрогеназы митохондрий восстанавливать светло-желтый МТТ тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) до нерастворимого темно-окрашенного формазана [11].

Перед проведением МТТ-теста образцы материалов помещали в лунки 48-луночного планшета и добавляли 600 мкл культуральной среды. Получали водные экстракты после 1, 4 и 7 сут инкубации при 37 °C. Клетки снимали с поверхности чашек Петри с помощью раствора Версена («ПанЭко», Россия) с добавлением 0,25% трипсина («ПанЭко», Россия) и высевали в 96-луночные планшеты («Thermo Fisher Scintific», США) с плотностью 5—10 тыс. клеток на лунку. Через 1 сут среду в лунках заменяли на экстракты и культивировали клетки 1 сут. В контрольные лунки добавляли среду, не контактировавшую с образцами, но также выдержанную при 37 °C. Затем в лунки добавляли МТТ («ПанЭко», Россия) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C, визуально контролируя развитие окраски. Реакцию останавливали, удаляя среду с МТТ. Кристаллы формазана экстрагировали из клеток с помощью диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин. Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм. Измерения проводили на планшетном ридере Anthos Reader 2020 («Anthos Labtec», Австрия).

Окраска трипановым синим. Метод основан на способности трипанового синего проникать сквозь поврежденную мембрану мертвых клеток [12]. Слабое окрашивание ядра этим красителем свидетельствует о некрозе клетки.

Клеточные культуры культивировали в присутствии водных экстрактов исследуемых веществ по методике, описанной в предыдущем разделе для проведения МТТ-теста. К окончанию 3, 7 и 14-х суток к 200 мкл питательной среды добавляли 50 мкл 0,5% водного раствора трипанового синего, инкубировали 5 мин, после чего трижды промывали раствором Хенкса. Далее производили фотосъемку в проходящем свете на микроскопе Axio Observer. Z1 с камерой AxioCam MRc 5 (D) («Carl Zeiss», Германия).

Для изучения адгезии клеток на поверхности носителей образцы матриц «заселяли» клетками, предварительно меченными витальным флюоресцентным красителем PKH-26.

Для заселения клетками матриц носителей готовили клеточную суспензию — клетки культур ММСК снимали с чашек Петри раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина и центрифугировали при 1100 об/мин в течение 10 мин. Окрашивание клеток красителем PKH-26 производили согласно инструкции производителя. После окрашивания клетки осаждали центрифугированием и получали клеточную суспензию с концентрацией 1·10⁶ клеток на 1 мл ростовой среды. Матрицы носителей помещали в 48-луночные планшеты («Thermo Fisher Scintific», США), наносили на них по 30 мкл полученной суспензии и инкубировали в течение 60 мин при стандартных культуральных условиях, а затем аккуратно добавляли 1 мл ростовой среды. Спустя 1 сут образцы с адгезированными на них клетками перекладывали в новые планшеты. Клетки на носителях культивировали при стандартных культуральных условиях, меняя ростовую среду каждые 3—4 сут. Для анализа использовали люминесцентный инвертированный микроскоп Axio Observer. Z1 с камерой AxioCam MRc 5 (D) («Carl Zeiss», Германия).

Для статистической оценки полученных данных и построения диаграмм использовалось специализированное программное обеспечение — GraphPad Prism 7 (США).

Нормальность распределения значений параметров в исследуемых группах оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка. Поскольку в исследуемых группах распределение значений соответствовало нормальному, для выявления межгрупповых различий использовали параметрический критерий Тьюки. За статистически значимые различия принимали результаты с вероятностью ошибки отклонения от нулевой гипотезы меньше 5% (p<0,05).

По данным МТТ-теста, культивирование AD-MSCs в присутствии водных экстрактов всех исследуемых материалов показало отсутствие статистически значимого негативного влияния на относительную выживаемость клеток (рис. 2).

Для ММСК из пульпы молочных зубов (SHED) было выявлено статистически значимое снижение относительного количества клеток при добавлении к питательной среде водных экстрактов материалов, содержащих ксеногенный ГА (см. рис. 3). Так, Bio-Oss и Индост гранулы способствовали снижению относительного количества клеток на 1, 4 и 7-е сутки эксперимента, а Биопласт — на 7-е сутки. В то же время другие классы материалов без ксеногенного ГА не оказывали значимого воздействия на относительную выживаемость SHED.

В центре лунок планшетов среди культивируемых клеток не было выявлено скопления окрашенных клеток. Однако ближе к периферической зоне лунок, куда добавляли водные экстракты Bio-Oss, Индост, на 1, 7 и 14-е сутки было обнаружено скопление клеток с ядрами, окрашенными трипановым синим, что свидетельствовало об их некрозе (рис. 4,).

Таким образом, окраска клеточных культур наглядно подтвердила цитотоксическое воздействие содержащих ксеногенный ГА костно-пластических материалов на SHED.

Все исследуемые материалы способствовали клеточной адгезии, несмотря на выявленный цитотоксический эффект содержащих ксеногенный ГА костно-пластических материалов на SHED. С 1-х суток эксперимента клетки распластывались и равномерно распределялись по поверхности материалов, изменяя свою форму с полигональной до вытянутой веретеновидной к 7-м суткам (рис. 5, см.

Данные о цитотоксическом влиянии на SHED костно-пластических материалов, содержащих ксеногенный ГА, соотносятся с результатами других исследований последних лет. Так, было показано, что миграция ММСК пульпарного происхождения в материал Bio-Oss происходит значительно менее интенсивно по сравнению с МТА-цементом и гранулированным дентином [13].

Результаты МТТ-теста свидетельствуют о подавлении пролиферативной активности SHED материалами, содержащими ксеногенный Г.А. Это могло быть обусловлено фенотипическими различиями ММСК из различных источников и степенью дифференцировки этих клеток [14—16]. Поскольку существуют данные о слабой остеоиндуктивной способности ГА [17, 18], можно предположить, что взвесь аморфного ГА с поверхности материалов могла попадать в питательную клеточную среду, где способствовала остеогенной или одонтобластической дифференцировке и подавляла тем самым клеточную пролиферацию SHED. Однако окраска трипановым синим наглядно подтвердила, что относительное снижение количества клеток по данным МТТ-теста было связано с некрозом.

Таким образом, с точки зрения цитосовместимости применение всех исследуемых костно-пластических материалов в клинической практике для замещения костных дефектов можно считать безопасным. При этом следует отметить, что трансплантация SHED на поверхности материалов, содержащих ксеногенный ГА, нежелательна.

Костно-пластические материалы из ксеногенного ГА оказывают цитотоксическое воздействие на ММСК, выделенные из пульпы выпавших молочных зубов, и не вызывают гибели клеток, выделенных из подкожного липоаспирата. Все исследованные отечественные костно-пластические материалы без ксеногенного ГА обладают высокой цитосовместимостью с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, полученными из пульпы выпавших молочных зубов и подкожного липоаспирата. Наилучшую цитосовместимость показали материалы на основе коллагенового гидрогеля.

Исследование выполнено в рамках темы поисковых научных исследований № 0517−2017−0015 государственного задания ФАНО России для ФГБНУ МГНЦ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Васильев Андрей Вячеславович — научный сотрудник отдела общей патологии ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России; e-mail: vav-stom@yandex.ru; тел: +7(926)813-3500; https://orcid.org/0000-0002-7169-2724 [Andrey V. Vasilyev — Central Research Institute of Dentistry and Maxillofacial Surgery; e-mail: vav-stom@yandex.ru; Ph.: +7(926)813-3500; https://orcid.org/0000-0002-7169-2724]

Bukharova T.B. — https://orcid.org/0000-0003-0481-256X

Goldstein D.V. — https://orcid.org/0000-0003-2438-1605