В настоящее время нет сомнений, что кариес — это мультифакторное заболевание. Помимо микробиологического аспекта, важными в развитии кариозного поражения зубов являются кариесрезистентность эмали, буферный эффект слюны, а также иммунные механизмы защиты полости рта от патогенных бактерий.
Как известно, десневая жидкость служит основным поставщиком лейкоцитов полости рта. При распознавании компонентов бактерий Toll-подобными рецепторами нейтрофилов, эпителиальных и эндотелиальных клеток выделяются антимикробные пептиды, к которым относят дефензины [1]. Это семейство малых цитотоксических и кислороднезависимых пептидов, обладающих активностью против широкого спектра бактерий, грибов и вирусов. В целом, описывая их свойства, можно отметить, что семейство малых цитотоксических и кислороднезависимых пептидов функционирует как мост между врожденным и приобретенным иммунитетом за счет своих хемотаксических свойств [2]. У человека выявлено 2 из 3 существующих классов дефензинов: α- и β-дефензины, отличающиеся по своему строению и свойствам. Все известные в настоящее время α-дефензины по тканевому происхождению можно разделить на нейтрофильные и кишечные [3]. В последнее время влияние этих пептидов при различных заболеваниях человека вызывает все больший интерес [4].
Известно, что в десневой жидкости содержится большое количество нейтрофилов, что приводит к наличию в данной биологической среде α-дефензинов 1—3 с динамично изменяющейся концентрацией в зависимости от микробной обсемененности пришеечной области зубов. [5]. Прямой антимикробный механизм действия этих пептидов начинается с адгезии к внешней стороне мембраны микроба, постепенного проникновения внутрь цитоплазмы и нарушения, таким образом, целостности мембраны микробных клеток, что последовательно ведет к гибели микроорганизма [6, 7]. Ввиду наличия дисульфидных связей дефензины развивают стойкость к микробным и лейкоцитарным протеазам в центре воспаления [8, 9]. Косвенно антимикробный эффект развивается за счет стимуляции усиленной секреции интерлейкина-8, хемотаксиса Т-клеток с киллерными функциями, нейтрофилов, выброса лейкоцитами продуктов окислительного взрыва, накопления радикалов супероксида кислорода и оксида азота, повреждения мембраны бактерий за счет генерации активных форм кислорода [10].
Описанное цитотоксическое действие дефензинов на эпителий слизистой оболочки полости рта нивелируется путем связывания их с альбумином, α1-антитрипсином, α2-антихимотрипсином и α2-макроглобулином [11]. В аспекте ограничения последствий окислительного стресса при накоплении в биологических средах полости рта α-дефензинов 1—3 важно знать особенности сопряжения между активностью гипоксия-зависимого фактора и антимикробными пептидами. Таким образом, логично предположить существование гипоксия-зависимого контроля активности врожденного антимикробного иммунитета [12]. В работе В.А. Рузаевой и соавт. [13] отмечено, что дестабилизация гипоксией индуцированного фактора-1α (ГИФ-1α) играет одну из ключевых ролей в модуляции воспалительных реакций, врожденном иммунитете, образовании биопленок и развитии антибиотикорезистентности микробов. Однако взаимосвязь антимикробных пептидов и ГИФ-1α в полости рта при кариесе зубов, как и при других стоматологических заболеваниях, при которых ключевым этиологическим фактором выступает микробный фактор, не изучена.
В связи с этим целью исследования было изучение взаимосвязи содержания α-дефензинов 1—3 и гипоксией индуцированного фактора-1α в десневой жидкости пациентов с кариесом ранее нелеченных зубов и рецидивом кариозного процесса.
Материал и методы
Исследование проводили в отделении терапевтической стоматологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России с ноября 2017 г. по декабрь 2018 г. Всего были обследованы и получили лечение 75 пациентов (39 мужчин и 36 женщин) в возрасте от 20 до 45 лет с диагнозом по МКБ-10 К02.1 «кариес дентина». Критериями включения были следующие: проживание в Москве, диагноз «кариес дентина» (К02.1 по МКБ-10) по классу I или II по Блэку. Критерии исключения: онкологические заболевания; аллергические реакции и соматические заболевания в фазе декомпенсации; патологические изменения пульпы, периодонта и слизистой оболочки; беременность; непонимание цели исследования. Перед включением в исследование всем пациентам были разъяснены условия проведения работы, после чего пациенты подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании.
Дизайн исследования: случай—контроль. Были сформированы 2 группы. В 1-ю группу вошли 30 пациентов с диагнозом «кариес дентина» в ранее нелеченном зубе, во 2-ю группу — 45 пациентов с рецидивом кариеса (в зубах, леченных не менее 12 мес назад). Для формирования 2-й группы были отобраны пациенты, ранее (не менее чем за 12 мес до участия в исследовании) проходившие лечение в этом же отделении, со значениями индексов гигиены и воспаления (Silness-Loe, 1964, Muhlemann в модификации Cowel, 1975) менее 1,0 на момент лечения. Это позволило исключить вероятность возникновения рецидива процесса по причине различий в технике лечения или использованных материалов либо стойкого неудовлетворительного уровня гигиенических навыков.
Диагноз устанавливали на основании совокупности жалоб и осмотра с использованием инструментов, кариес-детектора для подтверждения диагноза и при необходимости рентгенологического исследования. Для определения интенсивности распространения кариозного процесса в обеих группах «случай» мы также проводили оценку индекса КПУ с последующим расчетом его среднего значения для каждой группы отдельно. Для оценки гигиенического статуса и исключения патологии пародонта применяли индексы Silness-Loe (1964) и воспаления Muhlemann в модификации Cowel (1975).
В отделении терапевтической стоматологии используют стандартный протокол лечения кариеса дентина с обязательной изоляцией рабочего поля системой коффердам, пломбирование проводят светоотверждаемыми нанокомпозитами. Рецидив кариозного процесса определяли на основании жалоб и осмотра — наличия некротизированных тканей на границе пломбы и зуба и окрашивания этого участка кариес-детектором. До начала лечения в обеих группах при осмотре проводили сбор десневой жидкости в области кариозного зуба.
Группу контроля составили 25 практически здоровых лиц без выявленной во время обследования стоматологической патологии. Группа сравнения была сопоставима с исследуемыми группами по возрасту и полу участников исследования.
Содержание α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Сбор материала в области кариесассоциированного зуба осуществляли до лечения с помощью бумажных эндодонтических штифтов стандартного размера (№ 30) из десневой борозды, сорбируя жидкость в течение 30 с. Для приготовления образцов супернатантов десневой жидкости эндодонтический штифт помещали в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем центрифугировали в течение 10 мин при температуре 4 °C при 1500 об/мин. Полученный супернатант хранили при температуре –20 °С до постановки реакции. Определение концентрации α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости проводили с помощью набора реагентов Hycult Biotechnology (H.B.T.) (B.V., Нидерланды), содержания ГИФ-1α — Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha, HIF-1α («Cloud-Clone Corp.», США).
Статистический анализ полученных данных исследования проводили с помощью программы Statistica 12.0 («Stat Soft Inc.», США). Применяли модуль описательной статистики, корреляционного анализа, дисперсионного анализа.
Результаты и обсуждение
После клинического осмотра полости рта перед лечением у пациентов с диагнозом К02.1 «кариес дентина» интенсивность заболевания характеризовали путем индивидуального расчета индекса КПУ и нахождения средней величины в группах. Средняя величина индекса КПУ в 1-й группе составила 11,4±0,9, во 2-й группе 12,2±1,0. Уровень интенсивности кариеса зубов по суммарному индексу КПУ был средним, поскольку находился в диапазоне 6,3—12,7 балла как в 1-й, так и во 2-й группе. Средние значения индекса гигиены Silness-Loe составили 0,6±0,1 и 0,5±0,1, индекса воспаления Muhlemann (Cowel) — до 0,3±0,1 и 0,5±0,1 в 1-й и 2-й группах соответственно.
Концентрация α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости у пациентов с кариесом дентина в зависимости от анамнеза заболевания различалась (табл. 1).
В группе контроля содержание α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости составило в среднем 453,2±6,1 пг/мл при размахе значений от 412 до 513 пг/мл и межквартильном диапазоне 427—472 пг/мл (см. табл. 1).
У пациентов 2-й группы содержание α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости было наиболее высоким и превышало показатели больных 1-й группы на 28% (p<0,001). По сравнению со здоровыми лицами во 2-й группе концентрация антимикробного пептида превышала аналогичный показатель на 36% (p<0,001), а в 1-й группе имелось незначительное повышение уровня изучаемого антимикробного пептида (на 5%), хотя различия были статистически значимыми (p<0,001).
В десневой жидкости при кариесе дентина концентрация ГИФ-1α, имеющего большое значение для многих патофизиологических состояний, в том числе воспалительной реакции [14], резко различалась у пациентов 1-й и 2-й групп (табл. 2).
Так, во 2-й группе при рецидиве кариозного процесса содержание ГИФ-1α в жидкости десневого желобка было практически в 2 раза (p<0,001) выше, чем в 1-й группе при первичном поражении зуба кариесом. По сравнению со здоровыми лицами содержание ГИФ-1α в десневой жидкости в 1-й и 2-й группах было разнонаправленным. У пациентов 1-й группы происходило снижение концентрации на 11% (p<0,001). Во 2-й группе в сравнительном аспекте со здоровыми лицами концентрация ГИФ-1α была выше на 82% (p<0,001; см. табл. 1). У здоровых доноров в десневой жидкости содержание ГИФ-1α составило в среднем 93,6±1,5 пг/мл с размахом от 81 до 107 пг/мл.
От взаимосвязи изменений регуляторного транскрипционного и провоспалительного медиаторов, факторов врожденного иммунитета в биологических средах зависят интенсивность и характер течения воспалительного и деструктивного процесса микробной этиологии. В связи с этим на следующем этапе была изучена корреляция между медиаторами.
Результаты корреляционного анализа содержания α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости у пациентов с кариесом дентина в 1-й и 2-й группах, а также у здоровых лиц представлены в табл. 3.
В группе здоровых связь между изменением содержания α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости была тесной с коэффициентом корреляции R=0,78 (p<0,001). В 1-й группе взаимосвязанных сдвигов в концентрации α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости не наблюдалось (R=0,32; p>0,05). Во 2-й группе была установлена прямая статистически значимая связь между α-дефензинами 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости (R=0,78; p<0,001).
В группе здоровых пациентов высокая скученность точек корреляционного поля на малой площади и выраженный наклон линии регрессии подтверждали прямую тесную взаимосвязь накопления α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости (см. рисунок).
Принципиальное отличие корреляции между изменением содержания α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости и накоплением ГИФ-1α около кариес ассоциированного зуба в зависимости от первичности или вторичности деструкции твердых тканей зуба представляет собой впервые установленный научный факт. При рецидиве кариеса дентина содержание α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости было наиболее высоким при незначительном повышении уровня антимикробных пептидов у пациентов при первичном кариозном процессе. Содержание ГИФ-1α в жидкости зубодесневого желобка при кариесе дентина в интактном зубе было сниженным, а при развитии нового очага деструкции дентина на месте предыдущего кариозного поражения ГИФ-1α накапливался в биологической среде полости рта. Это позволяет предположить, что гипоксия-зависимый контроль врожденного антимикробного иммунитета при кариесе зубов, реализующийся сочетанным значительным повышением в десневой жидкости уровня ГИФ-1α и антимикробных пептидов, активировался при прогрессировании кариозного поражения дентина, несмотря на предшествующее лечение в кариесассоциированном зубе. Накопление ГИФ-1α в десневой жидкости при кариесе дентина в ранее леченном зубе косвенно свидетельствовало о локальных гипоксических изменениях в тканях, стабилизации и накоплении фактора, отсутствии его разрушения. ГИФ-1α стимулировал выделение антимикробных пептидов α-дефензинов 1—3, усиливающих накопление перекисей и радикалов, использования окислительных механизмов для разрушения бактерий. Следовательно, ГИФ-1α и α-дефензины 1—3 действуют синергично на кариесогенные бактерии через активацию окислительного стресса и активные формы кислорода.
Таким образом, развитие рецидива кариозного процесса в кариесассоциированном зубе сопряжено с гипоксия-зависимой активацией врожденного антимикробного иммунитета посредством накопления ГИФ-1α и сочетанным выраженным повышением в десневой жидкости α-дефензинов 1—3. Активация гипоксией индуцируемого контура регуляции врожденного антимикробного иммунитета наблюдалась только при вторичном кариозном поражении и привела к дополнительному стимулированию синтеза и секреции врожденных антимикробных факторов. Такая связь между изучаемыми медиаторами имела патогенетическую значимость, поскольку способствовала реализации дополнительных возможностей антимикробной защиты. Дальнейшие перспективы исследования на большой выборке пациентов позволят определить не только патогенетическую, но и прогностическую значимость оценки активности гипоксией индуцируемого механизма регуляции врожденного антимикробного иммунитета для анализа риска развития нового кариозного процесса, связанного с предшествующим, и применить меры по профилактике прогрессирования заболевания.
Заключение
Гипоксия-зависимая активация врожденного антимикробного иммунитета с накоплением α-дефензинов 1—3 и ГИФ-1α в десневой жидкости характерна при прогрессировании кариеса дентина в ранее леченном зубе и не наблюдается при первичном кариозном поражении. Патогенетическая значимость гипоксия-зависимого контроля врожденного антимикробного иммунитета при кариесе заключается в реализации дополнительных возможностей антимикробной защиты и обеспечении прироста концентрации антимикробных пептидов α-дефензинов 1—3 в десневой жидкости кариесассоциированного зуба.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Зорина О.А. — https://orcid.org/0000-0002-4143-4513
Борискина О.А. — https://orcid.org/0000-0002-1649-6448
Басова А.А. — https://orcid.org/0000-0002-3234-2721
Тупицин А.А. — https://orcid.org/0000-0003-3657-7605
Проходная В.А. — https://orcid.org/0000-0002-8173-9979
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Зорина О.А., Борискина О.А., Басова А.А., Тупицин А.А., Проходная В.А. Гипоксия-зависимый контроль активности врожденного антимикробного иммунитета у пациентов с кариесом дентина. Стоматология, 2019;98(5):-65. https://doi.org/10.17116/stomat201998051