Несмотря на накопленный опыт и широкий спектр технических возможностей, патогенез многих заболеваний человека до конца не изучен. Понимание всех звеньев патологического процесса не только помогает проводить эффективное лечение, но и позволяет разрабатывать новые диагностические инструменты. Кариес зубов — наиболее часто встречающаяся стоматологическая патология и, как следствие, — одна из основных причин потери зубов.

Давно доказано, что ведущей причиной возникновения кариозного процесса является микробный фактор. Расширение представлений о гигиенических процедурах, спектр средств для индивидуальной гигиены, постоянное совершенствование техники лечения и используемых материалов, к сожалению, не дают значительной редукции в приросте числа людей, имеющих кариес, в том числе с возникновением рецидивов процесса. Таким образом, поиск новых диагностических и прогностических инструментов для снижения распространенности кариозного процесса не теряет своей актуальности [1].

Одним из стимулов секреции и местного накопления в ткани антимикробных пептидов при повышении числа бактерий служит гипоксиязависимый фактор-1α (ГИФ-1α) [2]. Как известно, грамположительные бактерии используют в качестве сигнальных молекул N-ацилгомосеринлактоны и 2-алкил-4-хинолоны (2А4Х) [3]. 2А4Х приводят к деградации ГИФ-1α на протеасомном многобелковом комплексе 26S; это приводит к снижению экспрессии генов врожденного иммунитета и угнетению секреции антимикробных пептидов [4].

При гипоксии в тканях активируется гликолиз, что ведет к накоплению молочной и пировиноградной кислот, перекисных соединений, нарушению обмена кальция [5]. Усиление биосинтеза молочной кислоты в полости рта способствует развитию кариозного процесса. Локальное повышение концентрации ГИФ-1α сопровождает снижение напряжения кислорода в крови и тканях. При этом белковая молекула ГИФ-1α не гидроксилируется, остается стабильной и накапливается [6]. Направленность и характер изменения ГИФ-1α в жидкости десневого желобка, в том числе при кариесе дентина, неизвестны из-за того, что исследования в этом направлении не проводились. Несмотря на это, существуют работы, в которых ГИФ-1α определяли в слюне и биоптатах при различных онкологических заболеваниях (карцинома головы и шеи, слизистой оболочки полости рта) [7, 8], в синовиальной жидкости при патологии височно-нижнечелюстного сустава [9], аутоиммунных процессах [10]. Изменение тканевой экспрессии ГИФ-1α при онкологических и аутоиммунных процессах влияло на течение заболеваний, что позволяет предположить диагностическую информативность изучения гипоксиязависимого регуляторного фактора при инфекционной патологии полости рта.

Цель исследования — оценка диагностической информативности изменения концентрации гипоксиязависимого фактора в десневой жидкости пациентов для оценки риска рецидива кариозного процесса.

В исследование включили 75 пациентов (39 мужчин и 36 женщин) с диагнозом «кариес дентина» — К02.1 по МКБ-10, класс полостей I и/или II (по Блэку), проходивших обследование и лечение в отделении терапевтической стоматологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России (Москва) в период с ноября 2017 г. по январь 2019 г. При отборе участников руководствовались следующими критериями включения: возраст старше 18 лет; пульпа, периодонт, пародонт и слизистая оболочка полости рта без видимых патологических изменений; тяжелые соматические заболевания отсутствовали.

С учетом дизайна исследования была сформирована группа контроля, в которую вошли 25 практически здоровых лиц без выявленной стоматологической патологии. Возраст включенных в исследование пациентов варьировал от 20 до 45 лет.

У всех пациентов, принимавших участие в исследовании, определяли интенсивность кариеса зубов по интегральному показателю КПУ и эффективность гигиены полости рта с помощью индекса РНР. При значении индекса более 1,7, которое свидетельствует о неудовлетворительном уровне гигиены, пациента в исследование включали. Все пациенты подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании.

Пациенты с диагнозом «кариес дентина» были разделены на две группы. В 1-й группе (n=30) кариес дентина диагностировался в ранее не леченном зубе или зубах. Во 2-й группе (n=45) обследуемых диагностировали рецидив кариеса в ранее леченных зубе или зубах; эта группа была сформирована из пациентов, не менее 1 года назад проходивших лечение кариеса дентина (К02.1) по классу I и/или II в отделении терапевтической стоматологии и явившихся на контрольный осмотр или в связи с наличием жалоб. Техника ранее проведенного лечения в каждом случае была одинаковой и соответствовала мировым стандартам — с обязательной изоляцией системой коффердам, использованием кариес-детектора для объективной оценки полного удаления некротизированных тканей при препарировании, в качестве пломбировочных материалов использовали современные светоотверждаемые гибридные композитные материалы одной фирмы. Все это позволило исключить вероятность рецидива кариеса, связанного с ошибками в технике лечения. Для установления диагноза в 1-й и 2-й группах проводили стандартное клиническое обследование со сбором жалоб, визуальным и инструментальным осмотром, в том числе с применением кариес-детектора и при необходимости рентгенологического обследования.

Для исследования содержания ГИФ-1α и оценки количественного и качественного бактериального состава до лечения кариозного поражения в обеих группах при стоматологическом осмотре проводили сбор десневой жидкости в области кариозного зуба. Накануне проведения анализа пациентам было рекомендовано воздержаться от гигиенических процедур, в том числе с использованием антисептических средств, и приема пищи.

Содержание ГИФ-1α в десневой жидкости определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha — HIF1α («Cloud-Clone Corp.», США). Сбор десневой жидкости в области зуба, пораженного кариесом, осуществляли с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов размера № 30, сорбируя жидкость в течение 30 с. Для приготовления образцов супернатантов десневой жидкости эндодонтический штифт помещали в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем центрифугировали в течение 10 мин при температуре 4 °C при 1500 об/мин. Полученный супернатант хранили при температуре –20 °С до постановки реакции.

Бактериологическое исследование включало изучение представленности и количественной характеристики следующих микроорганизмов: Streptococcus mutans, Streptococcus sanquis, Streptococcus salivarius. Для этого также погружали на 30 с в десневую бороздку стерильный бумажный эндодонтический штифт (№ 30). Затем штифт помещали в пробирку типа Eppendorff с 0,5 мл полужидкой транспортной среды Эймса или Стюарта. Транспортировку в бактериологическую лабораторию осуществляли в специальных термоконтейнерах при температуре не выше –4 °С в течение 12 ч.

На первом этапе в бактериологической лаборатории десневую жидкость подвергали титрованию в изотоническом растворе натрия хлорида и высевали на питательную среду анаэробов — на Шедлера агар («BBL, Becton Diсkinson Diagnostics», Англия).

Культивирование микробов для исследования проводили в микроанаэростатах («BBL, Becton Diсkinson Diagnostics») при температуре 37 °C продолжительностью от 24 до 72 ч.

Для идентификации выделенных микроорганизмов учитывали характер роста колоний, подсчитывали число колониеобразующих единиц (КОЕ) каждого типа колоний, пересчитывали число КОЕ на 1 мл десневой жидкости и логарифмировали полученный показатель. Для оценки морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов использовали аппаратно-программный комплекс цифровой микроскопии ЗАО «ДиаМорф Cito» при увеличении 1:1000 и встроенный бинокулярный микроскоп Биолам. Биохимические свойства микроорганизмов изучали с помощью соответствующих идентификационных систем. Программный продукт API WEB для персональных компьютеров осуществлял идентификацию микроорганизмов согласно цифровому профилю.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы Statistica 12.0 («StatSoft Inc.», США). Математическая модель прогноза течения кариеса дентина была разработана методом логистической регрессии. Поиск прогностических параметров предикторов течения заболевания был осуществлен с помощью RОС-анализа при сопоставлении концентрации медиатора с наличием или в отсутствие прогрессирования заболевания. С помощью ROC-анализа для предиктора была определена дифференциальная точка разделения, позволяющая с максимальной диагностической чувствительностью и специфичностью сформулировать заключение о прогнозе течения заболевания. На ROC-кривой выстраивали соотношение между чувствительностью и специфичностью при различных уровнях показателя и находили точку, соответствующую разделительной. Площадь под ROC-кривой (AUC) позволила определить информативность лабораторного теста по стандартной шкале. Достоверность отличия AUC от площади, ограниченной диагональной линией y=x (AUC=0,5), оценивали по z-критерию и соответствующей ему доверительной вероятности р. Критическим принимали уровень р=0,05. При p≤0,05 отличие экспериментальной AUC от критической (AUC=0,5) считали статистически значимым, а, следовательно, предиктор — прогностически ценным.

После клинического осмотра полости рта перед лечением у пациентов с кариесом интенсивность заболевания характеризовали путем индивидуального расчета индекса КПУ и нахождения средней величины в группах. Средняя величина индекса КПУ в 1-й группе составила 11,4±0,9, а во 2-й группе — 12,2±1,0 (см. таблицу).

Сравнительный анализ не выявил различий между группами как интегрального показателя КПУ зубов, так и его составляющих по числу кариозных, пломбированных и удаленных зубов. Уровень интенсивности кариеса зубов по суммарному индексу КПУ был средним и находился в диапазоне 6,3—12,7 балла как в 1-й, так и во 2-й группе.

Высокая интенсивность кариеса зубов с колебанием индекса КПУ в диапазоне 12—28 баллов в 1-й группе встречалась у 6 (20%), а во 2-й группе у 8 (17%) пациентов. В остальных наблюдениях интенсивность кариеса зубов была средней: в 1-й группе — 24 (80%), во 2-й группе — 37 (83%).

У пациентов группы контроля содержание ГИФ-1α в десневой жидкости составило в среднем 93,6±1,5 пг/мл, медиана 93 пг/мл (межквартильный диапазон — 87; 99 пг/мл). У пациентов с кариесом дентина средняя концентрация ГИФ-1α в десневой жидкости составила 136,0±5,5 пг/мл, что на 45% больше (p<0,001), чем у здоровых лиц. Таким образом, в жидкости десневого желобка около зуба с кариозной полостью концентрация ГИФ-1α повышалась.

Содержание ГИФ-1α в десневой жидкости у пациентов 1-й и 2-й групп резко различалось. В 1-й группе при первичном поражении зуба кариесом в жидкости желобка концентрация ГИФ-1α составила 83,8±1,6 пг/мл, а во 2-й группе при рецидиве кариозного процесса была выше практически в 2 раза (p<0,001) и соответствовала в среднем 170,8±3,7 пг/мл.

По сравнению с группой контроля в 1-й и 2-й группах динамика содержания ГИФ-1α в десневой жидкости была разнонаправленной: у пациентов 1-й группы оно снижалось на 11% (p<0,001), а во 2-й группе увеличивалось на 82% (p<0,001).

При анализе бактериологического спектра чаще других микроорганизмов в содержимом десневого желобка у пациентов 1-й группы встречались кариесогенные S. salivarius (75,4%), S. mutans (70,8%), S. sanguis (64,6%). Во 2-й группе по частоте выявления среди микроорганизмов также превалировали S. sanguis (82,6%), S. mutans (80,4%), S. salivarius (76,1%). Обсемененность кариесогенными стрептококками в исследуемых группах была сопоставимой. У пациентов с кариесом дентина 1-й и 2-й групп была изучена корреляция между концентрацией бактерий микробиоты десневого желобка и концентрацией ГИФ-1α в десневой жидкости. Статистически значимая прямая связь была установлена между содержанием в десневой жидкости ГИФ-1α и количеством в микробиоте десневого желобка Streptococcus sanguis (R=0,43; p<0,001). Вероятно, транскрипционный фактор ГИФ-1α косвенно влиял на колонизацию бактерий в биотопах полости рта за счет регуляции антимикробного врожденного иммунитета.

ROC-анализ позволил уточнить, что у пациентов с кариесом дентина при исходном уровне ГИФ-1α в десневой жидкости более 98 пг/мл можно констатировать высокий риск рецидива кариозного процесса через 12 мес после лечения с чувствительностью 88,4% и специфичностью 78,1% (рис. 1).

Исследование соотношения чувствительности и специфичности, а также отношения шансов при различных концентрациях ГИФ-1α в десневой жидкости в области зуба, пораженного кариесом, показало, что при достижении уровня ГИФ-1α 98 пг/мл шансы рецидива кариозного процесса через 12 мес после лечения повышались в 4 раза (p<0,0001).

Методом логистического регрессионного анализа получено математическое выражение, которое позволяло рассчитать коэффициент прогноза возникновения рецидива кариеса. Выражение имело вид:

где К — коэффициент прогноза, ГИФ-1α — концентрация ГИФ-1α в десневой жидкости (в пикограммах на миллилитр), –6,0 — постоянная константа (определялась экспериментально методом логит-регрессии), 0,5 — коэффициент перед предикторной переменной (определялся экспериментально методом логит-регрессии).

Критерий χ² Пирсона составил 50,3 при р<0,0001, что указывало на статистическую значимость полученной математической зависимости между риском и величиной предиктора. На рис. 2 представлена

Полученное уравнение и соответствующий график позволили рассчитать риск прогрессирования кариеса дентина после лечения по исходной концентрации медиатора в десневой жидкости. При изменении концентрации ГИФ-1α в десневой жидкости с 80 до 170 пг/мл риск рецидива кариозного процесса через 12 мес после лечения увеличивался с 13 до 94% (рис. 3).

Согласно представленным данным, статистический анализ позволил установить концентрацию ГИФ-1α в десневой жидкости, сопряженную с риском рецидива кариозного поражения. Показано, что у пациентов до лечения при концентрации ГИФ-1α в десневой жидкости более 98 пг/мл риск рецидива кариеса дентина после предшествующего лечения повышается, что обусловливает необходимость стоматологического мониторинга с повышенной кратностью. Определение индивидуального риска рецидива кариозного процесса позволяет применить персонифицированные меры по профилактике прогрессирования заболевания.

Таким образом, прогностическая модель для выделения пациентов с высоким риском рецидива кариозного процесса, связанного с предшествующим, через 12 мес после лечения основывалась на анализе изменений концентрации ГИФ-1α в десневой жидкости. Следовательно, оценка системы гипоксиязависимого контроля активности врожденного антимикробного иммунитета играет высокозначимую роль для прогноза прогрессирования кариеса дентина после лечения.

1. Появление нового кариозного процесса через 12 мес после лечения сопровождается активацией гипоксиязависимого механизма контроля колонизации бактерий в биотопах полости рта.

2. У пациентов при концентрации в десневой жидкости ГИФ-1α более 98 пг/мл риск рецидива кариозного поражения после предшествующего лечения повышается, что требует увеличения кратности стоматологического мониторинга и применения профилактических гигиенических мероприятий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Зорина О.А. — https://orcid.org/0000-0002-4143-4513

Петрухина Н.Б. — https://orcid.org/0000-0003-3840-8127

Тупицин А.А. — https://orcid.org/0000-0003-3657-7605

Проходная В.А. — https://orcid.org/0000-0002-8173-9979

Максюков С.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-7823-8906

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Зорина О.А., Петрухина Н.Б., Тупицин А.А., Проходная В.А., Максюков С.Ю. Диагностическая и прогностическая значимость гипоксиязависимого транскрипционного медиатора для развития кариозного поражения. Стоматология. 2019;98(6):7-12. https://doi.org/10.17116/stomat2019980617

Автор, ответственный за переписку: Зорина Оксана Александровна — е-mail: zorina-cniis@yandex.ru