По данным отечественных и зарубежных исследований, среди всех заболеваний слизистой оболочки рта (СОР) наиболее сложными в диагностике и выборе тактики лечения являются пузырные поражения, такие как pemphigus vulgaris — истинная или вульгарная пузырчатка, pemphigoid bullosa — доброкачественная пузырчатка [1—4].
По мнению ряда авторов [5—7], этиологическими факторами в развитии пузырных поражений СОР служат генетическая и иммунологическая предрасположенность, воздействие вирусных и бактериальных агентов. Провоцирующими факторами рецидива данных заболеваний могут быть активация вирусных инфекций, прием бесконтрольного количества препаратов для лечения соматической патологии, психоэмоциональное перенапряжение [8—10].
В настоящее время в патогенезе пузырных поражений СОР ведущая роль отводится аутоиммунным процессам, развивающимся в ответ на изменение антигенной структуры клеток эпителия под воздействием различных повреждающих агентов [11, 12].
Интерлейкин (ИЛ)-1 инициирует ответ острой фазы воспаления, вызывая экспрессию множества медиаторов воспаления и в том числе ИЛ-6. В свою очередь помимо про- и противовоспалительного действия ИЛ-6 служит основным морфологическим показателем повреждения тканей. Таким образом, локализацию ИЛ-1 в СОР можно рассматривать как инициацию воспалительного ответа на повреждение клеток, а нахождение ИЛ-6 в зоне поражения характеризует выраженность патологических изменений [13].
В инициации пузырных поражений СОР принимают участие мононуклеары, кератиноциты, тучные клетки, а также клетки Лангерганса, в результате активации которых продуцируются аутоантитела и ряд про- и противовоспалительных цитокинов с последующей инфильтрацией участка слизистой оболочки Т-лимфоцитами, приводящей к клиническим проявлениям [14, 15]. Разрушение пораженных участков СОР является главным заключительным этапом аутоиммунного процесса.
Цель исследования — изучение иммуногистохимических критериев развития истинной пузырчатки (pemphigus vulgaris) и доброкачественной пузырчатки (pemphigoid bullosa) СОР.
Материал и методы
В настоящем исследовании использовали операционный материал, полученный в отделении заболеваний СОР (зав. — д.м.н. О.Ф. Рабинович), и архивный материал лаборатории патологической анатомии (зав. — д.м.н., проф. И.И. Бабиченко) ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава РФ за период с сентября 2016 г. по июнь 2019 г. Были исследованы биоптаты СОР 57 пациентов (38 женщин и 19 мужчин; средний возраст 52,5 года) с диагнозами pemphigus vulgaris и pemphigoid bullosa.
Биопсийный материал СОР при истинной пузырчатке (pemphigus vulgaris) и доброкачественной пузырчатке (pemphigoid bullosa) изучали при подозрении на малигнизацию процесса. Кусочки ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4) в течение 24 ч, после проводки на гистопроцессоре карусельного типа STP 120 и станции заливки EC-350, заливали в парафин с температурой плавления 54 °С. Затем изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые впоследствии окрашивались в автоматическом режиме гематоксилином и эозином на аппарате Microm HMS 740 Thermo scientific и заливались в канадский бальзам.
Для выявления генеза морфологических изменений в СОР при доброкачественной пузырчатке было исследовано участие вируса папилломы человека 16-го типа (HPV16) в формировании иммунных реакций, приводящих к изменениям в базальной мембране СОР. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) биопсийного материала проводили в лаборатории патологической анатомии ЦНИИС и ЧЛХ в соответствии со стандартным протоколом. Иммуногистохимические реакции осуществляли на приборе Autostainer 360 Thermo scientific.
Тканевые антигены определяли с помощью кроличьих поликлональных антител к Human papillomavirus type 16 (GTX 41503, GeneTex), кроличьих моноклональных антител к IL-1beta и мышиных моноклональных антител к IL-6 (AH 35-32), Hangzhou HuaAn Biotechnology Co., Ltd.
Результаты
Доброкачественная пузырчатка (pemphigoid bullosa) — заболевание, связанное с субэпителиальным повреждением слизистой оболочки. Характеризуется отделением эпителия от подлежащей соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки, содержащей воспалительный инфильтрат. Данное заболевание сопровождается выработкой аутоантител против компонентов базальной мембраны эпителия. Характерно наличие нейтрофилов, эозинофилов и клеток воспаления. На рис. 1, а, на цв. вклейке, представлена биопсия СОР при доброкачественной пузырчатке. Видно субэпителиальное разделение плоского эпителия от подлежащей собственной пластинки слизистой оболочки, при этом в сохранившейся зоне контакта эпителия с соединительной тканью собственной пластинки слизистой оболочки отмечаются вакуоли.
а — гистологическая картина, окраска гематоксилином и эозином, ×400; б—в — иммуногистохимическая реакция с антителами к HPV16 (б), к ИЛ-1 (в) и ИЛ-6 (г), окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ×400. СОР — слизистая оболочка рта; ДАБ — диаминобензидин.
С помощью ИГХИ выявили вирус HPV16 в клетках воспалительного инфильтрата и базальном слое эпителия (рис. 1, б). Эти данные свидетельствуют о том, что иммунокомплексные механизмы повреждения базальной мембраны эпителия при доброкачественной пузырчатке могут быть связаны с вирусом HPV16.
При доброкачественной пузырчатке ИЛ-1 преимущественно экспрессировался клетками воспалительного инфильтрата в зоне, прилежащей к базальному эпителиальному слою слизистой оболочки. В данной зоне отмечены повреждения межклеточных связей и развитие вакуолей (рис. 1, в).
ИГХИ при доброкачественной пузырчатке выявили выраженную экспрессию ИЛ-6 в эпителиальных клетках базального, шиповатого и поверхностного слоев, а также в воспалительном инфильтрате в собственной пластинке слизистой оболочки (рис. 1, г). С учетом того, что ИЛ-6 рассматривается как основной показатель повреждения клеток, выявленная нами выраженная экспрессия ИЛ-6 во всех слоях эпителия свидетельствует о его повреждении в результате нарушения трофических связей между собственной пластинкой слизистой оболочки и эпителием за счет формирования вакуолей.
Истинная пузырчатка (pemphigus vulgaris) характеризуется выработкой аутоантител против десмоглеина, компонента десмосом, которые связывают клетки между собой. В результате внутри эпителия над базальным слоем формируются пузыри.
При гистологическом исследовании выявляется интраэпителиальное разделение клеток непосредственно над базальным слоем, клетки которого приобретают округлую форму. Окружающая дефекты слизистая оболочка характеризуется парабазальным акантолизом, заключающимся в повреждении клеток шиповатого слоя эпителия с увеличением межклеточных лакун за счет разрушения межклеточных контактов.
В базальном слое располагаются круглой формы акантолитические клетки с эозинофильной цитоплазмой и пикнотическими ядрами. Парабазальное разделение клеток приводит к формированию волнистой формы соединительнотканных сосочков, окр2уженных клетками базального слоя. В подлежащей соединительной ткани выявляется хронический воспалительный инфильтрат (рис. 2, а, на цв. вклейке): видно парабазальное разделение эпителия с расположенными на базальной мембране акантолитическими клетками.
а — гистологическая картина, окраска гематоксилином и эозином, ×400; б—г — иммуногистохимическая реакция с антителами к HPV16 (б, ×200), ИЛ-1 (в) и ИЛ-6 (г), окраска ДАБ и гематоксилином Майера, ×400. СОР — слизистая оболочка рта; ДАБ — диаминобензидин.
Для выявления природы морфологических изменений в СОР при истинной пузырчатке было исследовано участие HPV16 в генезе иммунных реакций, приводящих к изменениям в базальной мембране СОР. С помощью ИГХИ выявили HPV16 в цитоплазме и ядрах эпителиальных клеток, а также в клетках воспалительного инфильтрата (рис. 2, б). Эти данные свидетельствуют о том, что иммунокомплексные механизмы повреждения в парабазальной зоне эпителия при истинной пузырчатке могут быть связаны с вирусом HPV16.
При истинной пузырчатке СОР основные патологические процессы происходят в шиповатом слое эпителия. На рис. 2, в представлена инфильтрация этой зоны лейкоцитами, в цитоплазме которых экспрессируется ИЛ-1, который также выявляется в эпителиоцитах шиповатого и базального слоев.
В слоях шиповатых клеток и базальных клеток отмечается выраженная экспрессия эпителиоцитами ИЛ-6 (рис. 2, г), что свидетельствует о выраженных повреждениях клеток данных эпителиальных зон. На рис. 2, г выявляется экспрессия ИЛ-6 и в клетках хронического воспалительного инфильтрата.
Таким образом, в настоящем исследовании при доброкачественной пузырчатке экспрессия ИЛ-1 отмечена в лейкоцитах, располагающихся под базальной мембраной, что свидетельствует об инициировании клеточного ответа в данной области, который приводит к формированию вакуолей и нарушению трофических связей между эпителием и собственной пластинкой слизистой оболочки. Подобные трофические нарушения в конечном итоге приводят к выраженным повреждениям клеток всех эпителиальных слоев слизистой оболочки, поскольку в них отмечается экспрессия ИЛ-6, и характеризуют буллезную форму заболеваний.
При истинной пузырчатке ИЛ-1 и ИЛ-6 выявляются в клетках воспалительного инфильтрата и кератиноцитах, расположенных в шиповатой зоне, при этом экспрессия ИЛ-6 в зоне более выраженная, чем при доброкачественной пузырчатке, что свидетельствует о значительных повреждениях клеток при данном виде патологии.
При доброкачественной пузырчатке и истинной пузырчатке нами выявлено распределение HPV16 в различных эпителиальных слоях, что может служить пусковым механизмом для последующей активации гуморального и клеточного иммунитета за счет ИЛ-1 и ИЛ-6.
Заключение
В связи с вышеизложенным пациентам с доброкачественной пузырчаткой (pemphigoid bullosa) и истинной пузырчаткой (pemphigus vulgaris) рекомендовано проводить исследование пораженных участков слизистой оболочки рта с помощью иммуногистохимических методов для дальнейшего прогнозирования течения и выбора тактики лечения данных заболеваний.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interests.