Перманентно увеличивающееся количество подлежащих определению наркотических и психотропных веществ обусловливает необходимость постоянного совершенствования методов их детектирования. Условно их подразделяют на предварительные и подтверждающие. Первые необходимы для определения класса, групповой принадлежности соединения, к ним относятся иммунохимические методы, тонкослойная хроматография, цветные тесты. Вторые служат для подтверждения результатов первых.

В наши дни широкое распространение получают иммунохимические методы, отличающиеся простотой проведения, экспрессностью, высокой специфичностью и тем, что практически не требуют пробоподготовки. К ним относятся такие, как поляризационный флюоресцентный иммуноанализ (ПФИА), различные модификации иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографический анализ (ИХА) и др. В основу иммунохимического анализа положена реакция взаимодействия антигена со специфичными к нему антителами, свойства которых в основном и определяют селективность и чувствительность метода. По составу антитела подразделяются на моноклональные (более специфичные), получаемые с помощью гибридом, и поликлональные (более чувствительные), получаемые из сыворотки крови иммунизированных животных, чаще всего кроликов. Однако антитела не образуют низкомолекулярные соединения, которые получили название «гаптены» или «неполноценные антигены», для получения иммунного ответа на которые необходимо прикрепить к ним белок-носитель с большой молекулярной массой (бычий сывороточный альбумин, овальбумин). Все наркотические и психотропные вещества являются гаптенами, поэтому необходим этап синтеза конъюгата перед иммунизацией.

Детектирование образовавшегося комплекса антиген—антитело осуществляется введением метки в один из исходных компонентов системы. В иммуноанализе могут применяться различные метки, обеспечивающие относительно простое и быстрое детектирование, а также необходимую для анализа чувствительность. Наиболее удобными для иммуноанализа оказались ферментные, флюоресцентные и парамагнитные метки. На ранних этапах проведения иммуноанализа развивались преимущественно гомогенные методы, однако постепенно гетерогенные, ввиду большего удобства при проведении анализа и отсутствия эффекта матрицы, заняли свою нишу в аналитической химии. Можно выделить несколько типов меток: золи металлов (коллоидное золото), частицы (эритроциты, латексы), ферменты (пероксидаза хрена), радионуклиды (тритий, йод-125), люминофоры и др. [1].

Из существующих методов химико-токсикологического иммуноанализа для амфетаминов разработаны ПФИА [2, 3], ИФА [4, 5] и ИХА [6, 7]. В наши дни на рынке аппаратуры для химико-токсикологического анализа можно найти готовые наборы, предназначенные для определения наркотических и психотропных веществ. При всех преимуществах ПФИА и ИФА имеют свои недостатки: высокая стоимость оборудования, необходимость в квалифицированном персонале, кроме того, ИФА достаточно долгий и не может быть скрининговым. В свою очередь ИХА на тест-полосках может быть проведен в домашних условиях, причем и время анализа не более 10—15 мин.

В данной работе была проведена оценка эффективности определения амфетаминов ИХА на тест-полосках и протестированы энергетические напитки ведущих фирм-производителей на предмет обнаружения амфетаминов; кроме того, тест-полоски были протестированы на перекрестные реакции с некоторыми лекарственными веществами.

Тест-полоски. Использовали тест-полоски на амфетамин и на метамфетамин. Температура всех анализируемых образцов, калибраторов, контролей и тест-полосок предварительно была доведена до комнатной (18—25 °C). При проведении теста полоску извлекали, не касаясь рабочей поверхности мембраны, затем строго в вертикальном положении погружали в исследуемый образец впитывающей частью, не доходя до линии MAX 1—2 мм, на 10 с. После этого ее извлекали и устанавливали строго в горизонтальном положении на невпитывающий материал. Через 5 мин проводили детектирование результатов. При визуальном детектировании отсутствие полосы в тестовой зоне указывало на наличие наркотика в образце выше пороговой концентрации 300 нг/мл (положительный образец мочи), наличие полосы — на то, что в данном образце наркотика нет (отрицательный образец мочи). По степени интенсивности тест-полосы проводили количественную регистрацию результатов с помощью специальной программы.

Стандартные растворы. Использовали калибраторы для проведения ПФИА фирмы «Abbott Diagnostics» (США) на амфетамин, калибраторы на метамфетамин отсутствовали.

Биологические образцы. Образцы мочи, содержащие амфетамины, были получены из химико-токсикологической лаборатории наркологической клинической больницы №17 Департамента здравоохранения Москвы, где проводились ИХА, ПФИА, газохроматографическая масс-спектрометрия (ГХ/МС), тонкослойная хроматография, по результатам которых образцы были отобраны. Для проверки отрицательного контроля использовали образцы мочи здоровых лиц, не употребляющих наркотические и психотропные вещества.

Энергетические напитки. Эксперимент с энергетическими напитками проводили с участием здоровых мужчин 22 лет и массой тела 80 кг; тесты на амфетамин давали отрицательный результат. До употребления напитка каждый раз брался контрольный образец для доказательства отсутствия наркотических веществ. Между проведением испытаний разных энергетических напитков выдерживали интервал в 2 дня. Каждый из энергетических напитков был употреблен в объеме 0,5 л. Состав энергетических напитков по данным производителей: Adrenaline RUSH — очищенная вода питьевая, сахар, двуокись углерода, регуляторы кислотности (лимонная кислота, цитрат натрия, фосфат калия), таурин, D-рибоза, L-карнитин, натуральный кофеин, витамин С, инозит, экстракт гуараны, экстракт женьшеня, витамины B₆, B₁₂, краситель (бета-каротин), мальтодекстрин, натуральный ароматизатор Adrenaline RUSH; Red Bull — вода, сахароза, глюкоза, регуляторы кислотности (лимоннокислый натрий, углекислый магний), углекислый газ, подкислитель (лимонная кислота), таурин, натуральный кофеин, глюкуронолактон, инозит, витамины (ниацин, пантотеновая кислота, витамины B₆, B₁₂), ароматизаторы (натуральные и искусственные), красители (сахарный колер, рибофлавин); Burn — вода, сахар, регуляторы кислотности (лимонная кислота, цитрат натрия), диоксид углерода, таурин, глюкуронолактон, натуральные и идентичные натуральным ароматизаторы, красители (сахарный колер IV и красный очаровательный АС), кофеин, сорбат калия, инозитол, витамины B₃, B₅, B₆, B₁₂, теобромин, экстракт гуараны, аскорбиновая кислота.

Кросс-реактивность. Для проведения теста на перекрестное реагирование были использованы следующие растворы лекарственных веществ: адреналин (1000 мкг/мл), гексоприналин (100 мкг/мл), димедрол (100 мкг/мл), ипратропия бромид (100 мкг/мл), мезатон (10 000 мкг/мл), сальбутамол (100 мкг/мл), фенотерол (100 мкг/мл), хлоропирамин (100 мкг/мл), эфедрин (100 мкг/мл).

Для определения низкомолекулярных соединений, таких как наркотические, применяли конкурентную иммунохроматографию, для чего использовали тест-полоски, включающие несколько зон: впитывающую, зону, на которой протекают иммунные реакции, и зону для манипулирования полоской. Чуть выше впитывающей зоны находится граница, обозначаемая MAX, ниже которой полоску опускать не следует для получения правильных результатов. Выше этой границы помещаются первичные антитела на определяемый антиген, меченные коллоидным золотом, визуально определяемым по фиолетовому цвету. Далее тестовая зона, на которой иммобилизуются антигены, а выше контрольная зона с иммобилизованными вторичными антителами против первичных. Методика проведения анализа заключается в погружении тест-полоски в пробу на определенное время или до достижения фронта трети зоны, на которой протекают иммунные реакции. После этого полоску извлекают и помещают на сухую, не впитывающую поверхность в горизонтальном положении. Механизм ИХА на тест-полосках описан в различных источниках [6, 7]. Обязательным условием является наличие полосы в контрольной зоне, в противном случае тест интерпретировать нельзя. Если на тест-полоске появилось две полосы, то результат отрицательный, если же одна полоса в контрольной зоне, то результат положительный.

ИХА тест-полоски — быстрый и удобный способ протестировать большое количество образцов, однако этому методу не хватает количественной интерпретации и способа регистрации. Хотя на рынке сейчас все больше появляется специальных ридеров, единственным недостатком которых является их высокая стоимость, существует альтернативный метод — программы, позволяющие анализировать интенсивность по сканированному изображению. Так, с помощью упомянутой выше программы была проведена калибровка тест-полосок на амфетамин по калибраторам фирмы «Abbott» для приборов TDx, результаты которой представлены в табл. 1.

Стандартные растворы амфетамина готовили из калибраторов фирмы «Abbott Diagnostics» путем разбавления «нулевой» мочой, не содержащей наркотиков и лекарств. Заявленная концентрация определения амфетамина — 800 нг/мл, но данные табл. 1 показывают, что интенсивность при концентрации амфетамина 1000 нг/мл все еще снижается, хотя уже незначительно и с широким интервалом отклика аналитического сигнала. Для описания зависимости концентрации от интенсивности на всем интервале с помощью аппроксимации в программе Microsoft office Excel было получено степенное уравнение С_х=915,49·Amp_х^-1,288 с величиной достоверности аппроксимации R²=0,9432. Результаты построения градуировочного графика продемонстрированы на рисунке.

На нем видно, что существует интервал (от 100 до 1000 нг/мл), при котором интенсивность снижается практически линейно. Также можно заметить, что график степенного уравнения можно разделить на два линейных участка, причем величина достоверности аппроксимации при этом будет выше, чем 0,950. Используя полученные уравнения, можно приблизительно определять концентрацию амфетамина в образце. Исходя из этого можно заключить, что существует возможность количественного определения других наркотических и психотропных веществ с помощью ИХА тест-полосок, для чего следует учитывать несколько важных моментов:

— верхний порог определения чаще всего следует принимать равным заявленной концентрации определения (для амфетамина 800 нг/мл), т.е. если получающееся при подсчетах значение больше заявленного, то его следует определять как большую концентрацию, чем заявленная;

— при снятии характеристик следует обязательно учитывать фон.

В результате испытаний показано, что ИХА тест-полосками можно определять концентрацию искомых веществ в интервале от минимальной достоверно фиксируемой (10—20 нг/мл) до концентрации, при которой интенсивность тестовой полосы равна нулю. В этом случае лучше всего для описания графической зависимости подходят степенные уравнения. Однако существует участок, в котором аналитический сигнал изменяется линейно, при этом функция принимает вид стандартного линейного уравнения вида: y=a·x+b, где y — искомая концентрация, x — аналитический сигнал, a, b — коэффициенты. Так, например, в результате калибровки тест-полосок одной фирмы на амфетамин был определен интервал возможного его детектирования — приблизительно от 15 до 800 нг/мл с погрешностью от 10 до 100 нг/мл, однако наиболее точно концентрация определяется на линейном участке падения аналитического сигнала, т.е. от 100 до 1000 нг/мл.

Проверка специфичности при больших концентрациях наркотических веществ проводилась на 17 образцах из химико-токсикологической лаборатории наркологической клинической больницы №17 Департамента здравоохранения Москвы. Отрицательный контроль тестировался на 15 образцах, заведомо не содержащих амфетаминов (табл. 2).

Из табл. 2 следует, что результаты строго коррелируют с данными инструментальных методов анализа (ГХ/МС), ввиду чего можно сделать вывод о том, что тест-полоски успешно определяют искомые наркотические вещества в моче. Кроме того, образец A4-2307, содержащий согласно инструментальным методам следы амфетамина, дал при анализе результат 80 нг/мл, хотя, если анализировать качественно, то наличие двух полос любой интенсивности дало бы ложноотрицательный результат.

Тестирование тест-полосок на специфичность. Тест-полоски на амфетамин выбранной фирмы обладают высокой специфичностью, что отражено в табл. 3;

Результаты опыта с энергетическими напитками. Каждый энергетический напиток употреблялся в объеме 0,5 л. Замеры производили через 2, 5 и 25 ч. Тест-полоски и на амфетамин, и на метамфетамин не давали положительного результата после употребления протестированных энергетических напитков. Это можно объяснить либо недостаточной чувствительностью, либо действительным отсутствием в напитках родственных амфетаминам веществ.

1. С помощью иммунохроматографических тест-полосок возможно эффективное качественное детектирование амфетамина и метамфетамина. Эти полоски обладают высокой специфичностью, что характеризуется минимальным количеством кросс-реакций с лекарственными веществами.

2. Проведено количественное определение с помощью тест-полосок по интенсивности окраски тестовой линии, которая может быть зарегистрирована с помощью сканера и специальной программы. Однако говорить можно только об интервале концентраций, в котором происходит изменение аналитического сигнала, так как при концентрации, превышающей пороговую или близкой к ней, изменения интенсивности практически не происходит.

3. Опыт показал необходимость количественной оценки при анализе с помощью тест-полосок, так как в противном случае увеличивается процент ложноотрицательных результатов.

4. Эксперимент с энергетическими напитками показал, что после их употребления в объеме 0,5 л иммунохроматографические тест-полоски показывают отрицательный результат, поэтому наличие в моче амфетаминов не является результатом употребления подобных напитков.