Скрининг лекарственных и наркотических веществ в биологических объектах играет очень важную роль в судебно-химических и химико-токсикологических исследованиях. Наркотические средства и лекарственные вещества — наиболее широко распространенные и весьма доступные токсиканты, круг которых многообразен и постоянно расширяется; они чаще всего являются причиной интоксикации либо смерти человека; данная группа соединений объединяет широкий спектр веществ с разнообразными физико-химическими свойствами.

Процесс подготовки проб, как известно, является наиболее трудоемкой и сложной стадией анализа образцов. В последние годы жидкость-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) все шире заменяют на твердофазную экстракцию (ТФЭ), так как это быстрый и простой метод, значительно сокращающий расходы за счет уменьшения количества используемых растворителей, числа операций и времени анализа. Применение ТФЭ также повышает чувствительность метода исследования за счет высокой эффективности экстракции целевых соединений и способствует низкому фону сопутствующих веществ матрицы в конечной пробе образца. В то же время большинство методов скрининга с применением ТФЭ ограничивается определенными группами веществ, чрезмерное употребление которых очевидно: амфетамины, опиаты, бензодиазепины, барбитураты и др. [1, 2]. Кроме того, в единичных работах описывается систематический скрининг с применением ТФЭ на патронах со смешанной фазой [3].

Цель данного исследования — изучение возможности применения метода ТФЭ на патронах SampliQ Evidex для расширенного скрининга лекарственных и наркотических веществ в крови методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии, применительно к задачам судебной медицины и токсикологии.

Для ТФЭ применяли систему с вакуумной камерой на 12 позиций («Supelco Inc»); газовый хроматограф Agilent 7820, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки 0,25 мкм; масс-селективный детектор Agilent 5975 («Agilent», США); термоблок ПЭ-4030; микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия); в качестве источника микроволнового излучения (МВИ) использовали бытовую микроволновую печь Rolsen MSI770SА (Россия); полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4—40, 40—200, 200—1000 мкл и 1—5 мл; патроны для ТФЭ SampliQ Evidex (200 мг/3 мл) со смешанной фазой. Все используемые растворители и реактивы имели квалификацию х.ч.

Cмесь стандартов №1 в этаноле содержала: 0,02 мг/мл амитриптилина, 0,02 мг/мл амфетамина, 0,06 мг/мл изониазида, 0,02 мг/мл диазепама и 0,01 мг/мл морфина (все в пересчете на основание).

Смесь стандартов №2 в этаноле содержала: 0,2 мг/мл фенобарбитала, 0,1 мг/мл индометацина, 0,1 мг/мл салициловой кислоты.

Используемые буферные системы:

1) 0,1 М цитратный буфер (рН 3,0); 2) 0,1 М цитратный буфер (рН 4,0); 3) 1/15 М фосфатный буфер (рН 4,8); 4) 1/15 М фосфатный буфер (рН 6,0).

Результаты расчетов получены с использованием ACD/I-Lab service («Advanced Chemistry Development Inc.», Toronto, Canada) по программам ACD/LogP v4.5, ACD/pKa v4.56, ACD/LogD v4.56, ACD/Adsorption Coefficient v4.0.

Основные этапы ТФЭ приведены в табл. 1.

Метилирование: к сухому остатку элюата I прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20—25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при 60 °С в течение 60 мин в термоблоке. Флакон охлаждали, отбирали 200 мкл реакционной смеси, испаряли в токе азота при 40 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хромато-масс-спектрометра (ХМС).

Ацетилирование: к сухому остатку элюата II прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида (обмывая стенки флакона), флакон плотно укупоривали и обрабатывали МВИ в СВЧ-печи с мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (не выше 40 °С). Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС.

Режим работы газового хроматографа с масс-селективным детектором. Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора — 250 и 280 °С соответственно. Температура колонки: начальная 70 °С в течение 2 мин, прогрев до 280 °С со скоростью программирования 20°/мин; выдержка при конечной температуре 8 мин. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин. Режим работы испарителя split/splitless (деление потока 15:1 с задержкой включения 1 мин после ввода пробы).

Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали на 200 В выше величины автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42—450 а.е.

Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов пробы проводили с использованием программы AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST). Количественные результаты получали с использованием программы ChemStation G1701DA.

Одной из проблем применения ТФЭ для скрининга лекарственных и наркотических веществ в крови, в частности трупной, является характер матрицы, не позволяющий в большинстве случаев получить плазму вследствие гемолиза крови, высокой вязкости, а также присутствия форменных элементов и фрагментов клеточных мембран, блокирующих фильтрующие материалы патронов и/или сами сорбенты.

Попытка использования для стадии ТФЭ дисков SPEC МР3 по аналогии с работами [4, 5] применительно к цельной крови привела к неудовлетворительным результатам вследствие высокой вязкости исследуемых образцов и блокирования пор дисков частицами объекта.

Для дальнейшего исследования в этом направлении нами были использованы патроны для ТФЭ SampliQ Evidex. Патроны серии SampliQ Evidex относятся к классическим «зернистым» патронам с сорбентом на основе силикагеля со смешанной привитой фазой. Данный тип смешанной фазы, включающей катионит (сульфогруппы) и гидрофобную фазу, позволяет выделять вещества как основного (в ионизированном виде), так и кислотного характера (в неионизированном виде).

Скрининг веществ в биологическом материале по сути является компромиссом в подборе условий извлечения и изолирования в отношении широкого круга веществ. Оптимальные условия экстракции соединений зависят от константы диссоциации, показателя липофильности, коэффициента адсорбции. В качестве модельных был выбран ряд соединений, охватывающих широкий диапазон основности и липофильности веществ.

В табл. 2

Приведенные выше данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальный диапазон значения рН среды при выделении перечисленных веществ с учетом применяемого типа патронов для ТФЭ ожидаем в интервале 3,0—6,0. Определяется это значением рК_a сорбента около 1 и величиной рК_a морфина, равной 8,14, таким образом, чтобы значение рН находилось на 2 ед. выше значения рК_a сорбента и настолько же ниже значения рК_a морфина.

Для предварительного прогнозирования поведения веществ основного и кислотного характера при выбранных значениях рН проведены расчеты величин коэффициента адсорбции (табл. 3).

При значениях рН среды в интервале 3,0—6,0 амфетамин, амитриптилин и морфин нацело ионизированы и будут взаимодействовать с примененным сорбционным материалом за счет ионных взаимодействий, гидрофобные взаимодействия либо отсутствуют, либо минимальны (для амитриптилина). Ионизация изониазида при рН 4,8 составляет лишь 9%, при рН 4,0 — около 50%, в то же время в интервале значений рН 4,0—6,0 могут наблюдаться слабые гидрофобные взаимодействия с сорбентом. Диазепам, фенобарбитал и индометацин будут удерживаться сорбентами посредством гидрофобных взаимодействий, при этом в интервале рН 3,0—4,8 не будет иметь значение характер ионизации веществ. Салициловая кислота в соответствии с расчетами имеет максимальное значение сорбции при минимальном значении рН, равном 3,0, при этом данное значение рН совпадает с рК_a анализируемого соединения.

В табл. 4 и 5

Как видно из полученных результатов, величина рН среды в интервале значений 3,0—6,0 практически не влияет на эффективность экстракции амфетамина и фенобарбитала. В том же интервале рН несколько различные, но достаточные выходы амитриптилина, диазепама и индометацина. Для морфина оптимальные результаты получены с фосфатным буфером при значениях рН, равных 4,8 и 6,0. Максимальный выход салициловой кислоты наблюдается при величине рН 3,0, что соответствует теоретическим предпосылкам. Для изониазида при величине рН 4,8 наблюдается незначительный, но максимальный выход с минимальной величиной девиации (±20%).

В процессе исследования было также отмечено, что использование цитратного буфера в процедуре ТФЭ проб крови при последующей дериватизации элюата II приводит к «осмолению» пробы. Последнее может иметь негативные последствия при дальнейшем анализе полученной пробы.

Для уменьшения потерь слабоудерживаемых веществ в процессе ТФЭ на этапе промывки после загрузки образца использовались минимальные объемы (по 1 мл) промывочных растворов. Также на этапе промывки было исключено применение 0,1 М уксусной кислоты. Раствор уксусной кислоты используется для усиления ионного взаимодействия между ионизированными аналитами и сорбентом. Последняя процедура не влияет на эффективность экстракции амфетамина, амитриптилина, диазепама, фенобарбитала и индометацина, при этом выход морфина снижается до 15±1,7%, а изониазид и салициловая кислота в пробе не определяются.

В табл. 6

ЖЖЭ проводили из 0,5 мл крови с добавлением модельных соединений при значениях рН 2,0 для веществ кислотного характера и рН 9,3 — для веществ основного характера аналогично методике, приведенной в работе [4]. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что метод ТФЭ для большинства модельных соединений более эффективен в сравнении с методом ЖЖЭ. Только для салициловой кислоты эффективность при использовании метода ЖЖЭ значительно превышает результаты, полученные методом ТФЭ.

Результаты исследования показали, что применение для пробоподготовки цельной крови патронов для ТФЭ SampliQ Evidex на основе «зернистых» сорбентов со смешанной фазой позволяет проводить скрининг широкого круга веществ кислотного и основного характера с широким диапазоном липофильности. Установлено, что ТФЭ показывает высокую селективность выделения исследованных веществ по фракциям и высокую эффективность их экстракции в сравнении с традиционным методом ЖЖЭ.

Оптимальным в скрининге наркотических средств и лекарственных веществ для патронов SampliQ Evidex является использование фосфатного буфера (рН 4,8), обеспечивающего максимальный выход веществ основного характера с низкой, средней и высокой липофильностью, а также веществ кислотного характера (со значением величины рК_a более 4) с разной степенью липофильности.

Использование патронов SampliQ Evidex для гидрофильных веществ слабоосновного характера (изониазид) и среднелипофильных веществ кислотного характера (салициловая кислота) показало низкую эффективность их экстракции при изученных условиях.

Таким образом, скрининг с применением патронов SampliQ Evidex возможен с учетом того, что слабоосновные гидрофильные вещества и вещества кислотного характера со значением рК_a ниже 3,8 от гидрофильного до среднелипофильного характера будут иметь по отношению к указанному сорбенту низкую селективность и будут выявляться только при значительных, т.е. при токсических и летальных концентрациях.