2-нитроанилин и 2-нитро-4-метиланилин (в дальнейшем 2-НА и 2-Н-4-МА) используются в производстве синтетических красителей, пластмасс, в текстильной промышленности, в синтезе лакокрасочных материалов, пестицидов, взрывчатых веществ, лекарственных средств [1—3].

По физическим свойствам это твердые, кристаллические вещества желтого или желто-оранжевого цвета без запаха, растворимые в этаноле, хлороформе, диэтиловом эфире, трудно растворимые в горячей воде, не растворимые в холодной воде [4].

Рассматриваемые 2-нитропроизводные анилина относятся к метгемоглобинобразующим ядам [5].

ЛД₅₀ 2-НА и 2-Н-4-МА для крыс при пероральном введении составляет 1838—3520 мг/кг [6, 7]. Описаны случаи отравления 2- и 4-нитропроизводными анилина, в том числе с летальным исходом [8].

В химико-токсикологическом отношении данные соединения изучены недостаточно.

Цель настоящего исследования — изучение особенностей определения 2-НА и 2-Н-4-МА в биологическом материале.

Объектами исследования явились 2-НА (фирма «Across Organic», содержание вещества 99,8%) и 2-Н-4 МА (ОАО «Заволжский химический завод им. М.В. Фрунзе», содержание вещества 99,3%).

На примере модельных смесей 2-НА и 2-Н-4-МА с тканью свежей печени от трупа человека проводили сравнительное изучение особенностей изолирования данных веществ из биологического материала жидкими изолирующими агентами различной химической природы.

Модельные смеси выдерживали при температуре 20—25 оС в течение 1,5 ч. Осуществляли двукратное изолирование исследуемых веществ при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания 45 мин. Извлечения из каждой отдельной смеси объединяли, часть объединенного извлечения наносили на пластину Сорбфил УФ-254 и хроматографировали, используя подвижную фазу гексан—ацетон (7:3). На хроматограммах наблюдали пятна 2-НА желтого цвета (R_f=0,69) и 2-Н-4-МА желто-оранжевого цвета (R_f=0,73). В УФ-свете пятна данных веществ имели темную окраску. То или иное вещество элюировали из сорбента диметилформамидом в течение 15 мин. Оптическую плотность полученного элюата измеряли при 281 нм (2-НА) или 285 нм (2-Н-4-МА) на приборе СФ-2000 в кювете с длиной оптического пути 10 мм. По величине оптической плотности определяли количество 2-НА или 2-Н-4-МА, используя уравнения градуировочных графиков.

Исследовали зависимость степени извлечения 2-НА и 2-Н-4-МА оптимальным изолирующим агентом из биоматериала от кратности настаивания, продолжительности контакта изолирующей жидкости с биологическим объектом, количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.

Изучены особенности очистки 2-НА и 2-Н-4-МА, выделенных из биологического материала, методами экстракции и обращенно-фазовой колоночной хроматографии.

При очистке методом экстракции ацетоновое извлечение из биоматериала упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка. Остаток растворяли в 10 мл ацетонитрила, прибавляли 40 мл буферного раствора с рН 9,0 и экстрагировали 50 мл этилацетата, насыщенного водой, двукратно (оптимальные условия). Экстракты объединяли и испаряли до сухого остатка.

Исследовали хроматографическую подвижность рассматриваемых нитроанилинов в колонке размером 120×11 мм, заполненной 7,5 г сорбента Silasorb С18 с размером частиц 30 мкм. В качестве элюентов рассмотрены ацетонитрил и его смеси с водой. Элюаты собирали фракциями по 2 мл каждая. Вещества обнаруживали во фракциях методом тонкослойной хроматографии — ТСХ (пластины Сорбфил УФ-254, обработанные 10% раствором вазелинового масла в гексане (модель привитой фазы С₁₄ — С₁₅); подвижная фаза ацетонитрил — вода (5:5); объем фракции, наносимый на пластину 5—10 мкл).

В контрольных опытах с тканью трупной печени человека, заведомо не содержащей 2-НА и 2-Н-4-МА, сухой остаток извлечения из 25 г биоматериала растворяли в 10 мл ацетонитрила, прибавляли 40 мл буфера с рН 9,0 и экстрагировали 50 мл этилацетата, насыщенного водой, двукратно. Экстракты испаряли до сухого остатка и хроматографировали на колонке. Фракции, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и растворяли остаток в 25 мл системы растворителей гексан–диоксан–пропанол-2 (40:5:1) с последующим измерением оптической плотности раствора при 238 нм (система растворителей и длина волны соответствуют условиям определения 2-НА и 2-Н-4-МА методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ).

Для обнаружения и предварительной идентификации 2-НА и 2-Н-4-МА, выделенных из биологического материала, изучена возможность применения хроматографии в тонких слоях нормально-фазового (пластины Сорбфил УФ-254) и обращенно-фазового (силикагель на пластинах Сорбфил УФ-254, обработанный вазелиновым маслом) сорбентов.

Для подтверждающей идентификации и количественного определения 2-НА и 2-Н-4-МА, выделенных из биологического материала и очищенных экстракцией и колоночной хроматографией, применен метод ВЭЖХ. Хроматографировали на приборе Милихром с УФ- детектором, в колонке размером 62×2 мм с сорбентом Силасорб-600. В качестве подвижных фаз рассмотрен ряд малополярных систем растворителей.

На рисунке

Как свидетельствуют полученные данные, максимальная степень извлечения изучаемых веществ достигнута при изолировании ацетоном. Для достаточно полного извлечения анализируемых соединений из биоматериала достаточно двукратного настаивания биологического объекта с изолирующим агентом при условии, что количество ацетона в каждом случае должно превышать количество биологического материала по массе как минимум в 2 раза, а продолжительность каждого настаивании должна составлять не менее 30 мин.

Исследование хроматографической подвижности 2-НА и 2-Н-4-МА в колонке с сорбентом Silasorb С18 30 мкм показало, что оптимальной в данном случае является подвижная фаза ацетонитрил — вода (5:5) (табл. 1).

В контрольных опытах с тканью печени, не содержащей 2-НА или 2-Н-4-МА, установлено, что фоновое поглощение части элюата, соответствующего фракциям, в которых могут содержаться анализируемые вещества, весьма незначительно (не превышает 0,018 при 230 нм – аналитической длине волны для определения методом ВЭЖХ).

Результаты исследования хроматографической подвижности 2-НА и 2-Н-4-МА в тонких слоях сорбентов показали, что оптимальными подвижными фазами при нормально-фазовом варианте ТСХ являются системы растворителей гексан—ацетон (7:3) и гексан—диэтиловый эфир (5:5), при обращенно-фазовом варианте — системы вода—ацетонитрил (5:5) и буферный раствор с рН 2,0 —диоксан-1,4 (2:8).

В качестве элюента для определения 2-НА и 2-Н-4-МА методом ВЭЖХ применена система растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин, скорость движения диаграммной ленты — 720 мм/ч, масштаб регистрации — 0,8 ед. опт. пл., время измерения — 0,6 с. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 238 нм. Параметры хроматографирования 2-НА: время удерживания (t_R) — 6,51 мин, объем удерживания (V_R) — 651 мкл, коэффициент емкости (kʹ) равен 2,88; число теоретических тарелок (n) — 3520. Эти же параметры 2-Н-4-МА составили соответственно 5,27 мин, 527 мкл, 2,14 и 2791. Для количественного определения анализируемых веществ строили градуировочные графики зависимости площади хроматографического пика от содержания вещества в хроматографируемой пробе. Уравнения градуировочных графиков имели вид:

S=18,71756×C – 0,00454 (для 2-нитро-4-метиланилина),

S=22,64298×C+0,01403 (для 2-нитроанилина),

где S — площадь пика, С — содержание вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Графики линейны в интервале концентраций рассматриваемых веществ 0,02–0,48 мкг в хроматографируемой пробе.

Предлагаемая схема очистки, включающая экстракцию и колоночную хроматографию, позволяет в значительной степени исключить искажающее влияние соэкстрактивных веществ биологического материала на результаты определения 2-НА и 2-Н-4-МА методом ВЭЖХ. При этом на хроматограммах исследуемых веществ, выделенных из биологического материала, по сравнению с хроматограммами чистых веществ не обнаруживаются дополнительные пики и заметное увеличение фонового поглощения. Параметры хроматографирования 2-НА и 2-Н-4-МА, извлеченных из биоматериала, совпадают с таковыми чистых веществ.

Методика определения 2-НА и 2-Н-4-МА в биологическом материале

Изолирование. 25 г биологического материала (мелкоизмельченная ткань печени от трупа), содержащего исследуемое вещество, заливали 50 мл ацетона и выдерживали 30 мин при периодическом перемешивании. Извлечение сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли в описанных выше условиях. Отдельные извлечения объединяли в выпарительной чашке и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

Экстракционная очистка. Сухой остаток растворяли в 10 мл ацетонитрила, прибавляли 40 мл буферного раствора с рН 9,0 и экстрагировали 50 мл этилацетата, насыщенного водой двукратно. Экстракты объединяли, испаряли в токе воздуха при комнатной температуре до полного удаления органического растворителя.

Очистка на колонке. Остаток, полученный после испарения растворителя из объединенного экстракта, растворяли в 2 мл смеси растворителей ацетонитрил—вода (5:5). Полученный раствор вносили в стеклянную хроматографическую колонку размером 120×11 мм, заполненную 7,5 г Silasorb С18 с размером частиц 30 мкм и после полного вхождения раствора в слой сорбента элюировали системой растворителей ацетонитрил—вода (5:5). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. 2-НА и 2-Н-4-МА во фракциях обнаруживали путем нанесения 5—10 мкл каждой из них на хроматографическую пластину Сорбфил УФ-254 и хроматографирования с использованием подвижной фазы гексан—ацетон (7:3). Элюент из фракций, содержащих исследуемые вещества, испаряли в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10 мл 1,4-диоксана.

Идентификация методом ТСХ. 0,4 мл диоксанового раствора наносили на линию старта хроматографической пластины типа Сорбфил УФ-254. Хроматографировали, применяя в качестве элюента систему растворителей гексан—ацетон (7:3), в присутствии веществ-свидетелей. Анализируемые вещества идентифицировали по величине R_f.

Идентификация и количественное определение методом ВЭЖХ. 2,5 мл диоксанового раствора вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 0,5 мл пропанола-2, 20 мл гексана и доводили до метки смесью растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). 2—8 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. При необходимости раствор предварительно разбавляли смесью гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1). Хроматографировали в колонке размером 64×2 мм с сорбентом Силасорб-600. Подвижная фаза — гексан—диоксан—пропанол-2 (40:5:1), которую подавали со скоростью 100 мкл/мин. Оптическую плотность регистрировали при 238 нм. Определяемые вещества идентифицировали по времени (объему) удерживания. Количественное содержание того или иного соединения рассчитывали, исходя из площади хроматографического пика, с использованием уравнения градуировочного графика.

Результаты количественного определения 2-НА и 2-Н-4-МА в ткани печени от трупа представлены в табл. 2.

Как свидетельствуют полученные данные, увеличение содержания 2-НА и 2-Н-4-МА в модельных смесях в интервале концентраций 1,0—50,0 мг при постоянной массе навески печени (25 г) сопровождалось лишь незначительным изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 1,75%. Использование ацетона в качестве изолирующего агента и предложенные условия изолирования и очистки позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения анализируемых соединений из ткани печени трупа (73,16—77,98%). Открываемый минимум составляет 0,05 мг 2-НА и 2-Н-4-МА в 100 г биологического материала. Разработанная методика хорошо воспроизводима и отличается достаточной простотой выполнения.

1. Опытным изолирующим агентом 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из биологического материала является ацетон.

2. Очистка анализируемых веществ, изолированных из биологического объекта, возможна методами экстракции и колоночной хроматографии.

3. Разработана методика идентификации и количественного определения 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в извлечениях из трупного материала с применением методов ТСХ и ВЭЖХ.