Масс-спектрометрия является высокоточным инструментом исследования физико-химических характеристик сложных биологических молекул. В академической науке - биологии и химии - метод зарекомендовал себя как надежный инструмент, используемый для решения разнообразных фундаментальных научных и прикладных задач. Попытки внедрения масс-спектрометрических методов анализа нуклеиновых кислот в арсенал судебно-медицинских молекулярно-генетических лабораторий предприняты сравнительно недавно [1].

В 2008-2009 гг. компанией «Ibis» (позднее - «Abbot Molecular», США) разработана автоматизированная аналитическая платформа, получившая коммерческое наименование PLEX-ID. Это инструмент масс-спектрометрического анализа амплифицированных фрагментов ДНК для молекулярно-генетической идентификации человека [2].

Провели исследование возможностей аналитической платформы PLEX-ID и сравнение этой технологии с традиционным электрофоретическим анализом полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК человека. Дана оценка перспектив использования масс-спектрометрического анализа для решения задач современной судебно-медицинской генетики.

Исследовали индивидуальные образцы биологического материала от 660 человек (образцы буккального эпителия и крови). Для выделения препаратов ДНК использовали набор реагентов PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit («Applied Biosystems», США).

Для 460 препаратов провели типирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК, а для оставшихся 200 - анализ полиморфизма последовательности контрольного региона митохондриальной ДНК (мтДНК).

Все препараты ДНК, подвергнутые масс-спектрометрическому анализу, предварительно исследовали с использованием традиционных молекулярно-генетических методик, а именно анализа ПДАФ и ППАФ с помощью капиллярного электрофореза.

Предварительный анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) аутосомных STR-локусов геномной ДНК проводили с помощью панели AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3130 («Applied Biosystems», США).

Для предварительного анализа полиморфизма последовательности амплифицированных фрагментов (ППАФ) контрольного региона мтДНК использовали систему энзиматической амплификации, разработанную П.Л. Ивановым [3]. Затем проводи прямое секвенирование флуоресцентно меченных амплификационных продуктов на автоматизированном аппаратно-программном комплексе АВI PRISM 3130 («Applied Biosуstems», США) со штатным набором реагентов этой же фирмы.

ПДАФ хромосомных STR-локусов геномной ДНК анализировали с использованием панели PLEX-ID STR CODIS loci 120 Tests («Abbott Molecular», США), а продукты ПЦР - автоматизированного комплекса PLEX-ID Instrument («Abbott Molecular», США).

Анализ ППАФ контрольного региона мтДНК проводили с помощью панели Human Mitochondrial Typing Assay Kit («Abbott Molecular», США), а продукты ПЦР - автоматизированного комплекса PLEX-ID Instrument («Abbott Molecular», США).

Процесс масс-спектрометрического исследования амплифицированных фрагментов ДНК с использованием технологии PLEX-ID условно можно разделить на несколько этапов, каждый из которых следует рассматривать в качестве отдельного звена общей технологической цепочки:

- амплификация фрагментов ДНК;

- очистка ампликонов;

- ионизация;

- получение масс-спектров;

- анализ спектральных данных;

- анализ установленных генотипических признаков.

Все этапы представляют отдельные задачи, отличающиеся характерным набором специфических особенностей. Выполнили валидационные (оценочные) исследования всех стадий масс-спектрометрического анализа и провели сравнение с аналогичными стадиями традиционного (электрофоретического) анализа амплифицированных фрагментов ДНК.

В ходе работы проявились некоторые обстоятельства, в первую очередь технического и технологического характера, которые несомненно следует отнести к недостаткам данного подхода. Они отражены в отдельной публикации [4]. Основное внимание необходимо сконцентрировать на потенциальных преимуществах масс-спектрометрического анализа.

Анализ получаемых масс-спектров представляет собой последовательное решение двух задач. Первая заключается в точном определении масс-зарядового отношения для двух цепей исследуемого ДНК-фрагмента на основании полного спектра их протонированных форм (так называемая деконволюция спектров). Эта задача решается встроенными программными средствами. Вторая задача анализа - интерпретация установленных значений масс прямой и обратной цепей ДНК на уровне нуклеотидного состава исследуемой молекулы. Достигаемый в PLEX-ID уровень точности определения массы позволяет определять не только длину ампликона (количество мономеров), но и его нуклеотидный состав (без учета последовательности).

С одной стороны, такой объем информации оказывается сниженным по сравнению с результатами электрофоретического секвенирования (традиционно применяется при исследовании мтДНК). Кроме того, дополнительным источником потери информации может стать наличие таких, например, симметричных нуклеотидных замен, как двойная замена C⇒T + T⇒C.

С другой стороны, масс-спектрометрический анализ оказывается существенно более информативным, чем традиционное электрофоретическое типирование ПДАФ хромосомной ДНК, которое позволяет судить только о длине молекул.

В нашем исследовании незначительное снижение информативности анализа контрольного региона мтДНК (в сравнении с прямым секвенированием) не оказало существенного влияния на достоверность экспертной оценки полученных данных. Среди 180 успешно протипированных образцов (73 гаплотипа) не выявили ни одного случая ложного совпадения различающихся митотипов, вызванного отсутствием сведений о первичной последовательности ДНК. Это согласуется с данными разработчиков PLEX-ID [5]. Проявилась другая принципиальная проблема, связанная с отсутствием доступных данных о популяционных частотах гаплотипов мтДНК, определенных на уровне именно нуклеотидного состава. Дело в том, что частота встречаемости масс-спектрометрически определяемых митотипов не может быть оценена напрямую в существующих в настоящее время базах данных, так как необходима их предварительная конвертация в единый формат. На практике это означает невозможность вероятностной оценки выявленного совпадения признаков, что является существенным препятствием для внедрения масс-спектрометрического анализа мтДНК в экспертный процесс.

Особый интерес представляют результаты анализа смешанных препаратов мтДНК. Одним из заявленных преимуществ технологии PLEX-ID должна была стать высокая эффективность разделения компонентов смесей генетического материала нескольких лиц. Такая особенность данного метода теоретически ожидаема.

Действительно, принцип высокоточного определения масс-зарядового соотношения индивидуальных молекул позволяет эффективно разделять сигналы ампликонов, отличающихся между собой даже в одной единственной позиции. Соответственно, если располагать точной информацией о характерном уровне амплитуды сигнала отдельных компонентов смешанного спектра, задача анализа смешанных препаратов ДНК может быть выполнена с достаточно высокой эффективностью.

Важным условием проведения такого анализа является отсутствие значимых различий в эффективности амплификации полиморфных позиций исследуемых ампликонов. Различия в амплитуде сигнала отдельных компонентов должны зависеть только от количества исходной ДНК матрицы. Это условие выполняется в случае, если полиморфные позиции находятся в составе одного ампликона (как следствие синтезируются в одной и той же реакции). В ходе исследований модельных смешанных препаратов ДНК (с известным количественным соотношением и известными митотипами отдельных компонентов) установили, что различия в эффективности отдельных реакций существенно влияют на уровень амплитуды получаемых спектров.

Если две полиморфные позиции амплифицируются в разных реакциях (в составе разных фрагментов), различие в амплитуде детектируемого сигнала (хотя и определенного с высокой точностью) не всегда позволяет точно судить о количественном соотношении исходных компонентов смеси. На рис. 1 (на цв. вклейке)

По результатам проведенных исследований были сформулированы некоторые обобщенные выводы относительно возможностей интерпретации масс-спектров смешанных объектов.

1. Количественное соотношение, необходимое для выявления сигнала отдельных компонентов смеси, зависит от конкретной реакции, в рамках которой проводится амплификация полиморфной позиции. В общем случае превышение доли одного из компонентов более чем в 10 раз приводит к возможному выпадению сигнала минорной фракции.

2. Интерпретация смешанных спектров для позиций, находящихся в составе различных ампликонов, зависит от эффективности конкретных рассматриваемых реакций. Искажения амплитуды сигнала, вносимые на уровне ПЦР, не всегда позволяют установить даже количество отдельных компонентов смеси.

3. При отсутствии исходной информации об истинном соотношении компонентов смеси в рамках реальной экспертной задачи достоверность интерпретации смешанных масс-спектров не может быть признана удовлетворительной. Такой подход не может быть рекомендован в качестве экспертной методики.

Возможности масс-спектрометрического подхода применительно к анализу полиморфизма STR-маркеров аутосомной ДНК мы считаем более перспективными. Наличие информации о нуклеотидном составе ампликонов позволяет оценивать не только длину амплифицированных фрагментов, но и выявлять отклонения их массы от «усредненно-расчетной».

Эти так называемые масс-микроварианты представляют собой такие аллельные состояния STR-локусов, которые различаются не только количеством присутствующих тандемных повторов, но и нуклеотидной последовательностью, в частности наличием однонуклеотидных замен или SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Выявленный эффект расщепления «канонических» (определяемых электрофоретически) аллелей на несколько вариантных форм можно рассматривать как потенциальный источник повышения информативности экспертного исследования. Иллюстрацией практической значимости данного эффекта может служить сложный случай установления отцовства из нашей практики.

Несовершеннолетняя была изнасилована неизвестным, в результате чего забеременела. По условию экспертной задачи, отцом ребенка (следовательно, насильником) мог быть либо родной отец потерпевшей, либо ее брат. В ходе проведенного исследования выполнили типирование 30 аутосомных STR-локусов в геноме потерпевшей, двух предполагаемых насильников и представленного на исследование плодного материала. Выявить биологического отца ребенка (обоснованно выбрать одного из двух возможных) не удалось: сложность задачи была в высокой степени родства двух мужчин. Для всех исследованных локусов обнаружили совпадение аллельных вариантов, установленных в геноме ребенка, как минимум с одним из аллелей в генотипах обоих предполагаемых отцов исследованного плода (находящихся между собой в прямом родстве как отец и ребенок). В качестве примера характерного результата типирования приводим STR-профиль, установленный для локуса D21S11: мать - генотип 29,30, ребенок (плод) - 29,30, предполагаемый отец №1 - 30,30, предполагаемый отец №2 - 30,30 (рис. 2, на цв. вклейке).

Для 4 препаратов ДНК, полученных при проведении данной экспертизы, провели масс-спектрометрическое исследование 13 аутосомных STR-локусов с использованием системы PLEX-ID. Все установленные аллельные комбинации оказались полностью идентичны их электрофоретически определенным аналогам. Для одного из 13 исследованных локусов, а именно D21S11, выявили расщепление канонического аллеля 30 на две вариантные формы - 30 и 30 (A⇒G). Характер наследования этих форм у 4 фигурантов дела позволил достоверно исключить одного из предполагаемых отцов и решить поставленную экспертную задачу (рис. 3, на цв. вклейке).

Таким образом, если не обсуждать ряд нерешенных на данный момент технических проблем, повышение информативности анализа полиморфизма STR-маркеров аутосомной ДНК может стать весьма значимым преимуществом масс-спектрометрического подхода. Реальная оценка значимости эффекта расщепления классических аллельных вариантов STR-локусов хромосомной ДНК требует тщательного изучения статистических показателей распределения аллельных масс-микровариантов в реальных популяциях.

Проведенное исследование продемонстрировало наличие ряда потенциальных преимуществ масс-спектрометрического анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК над традиционными методами, основанными на технологии капиллярного электрофореза. Повышение информативности анализа полиморфизма STR-локусов хромосомной ДНК за счет открывающейся возможности выявления в них SNP и расширения таким образом их аллельного спектра можно считать самым значимым преимуществом масс-спектрометрического подхода.

Платформа PLEX-ID, являющаяся на данный момент единственным примером реализации технологии масс-спектрометрического анализа ДНК для целей судебно-медицинской генетики, в современном своем состоянии имеет ряд серьезных технологических недостатков. Наличие выявленных нами проблем требует дальнейшей доработки существующей технологии, необходимой для успешного внедрения масс-спектрометрических методов исследования в реальную экспертную практику.

Все необходимые рекомендации доведены нами до сведения разработчика. Они будут учтены при дальнейшем совершенствовании оборудования.