Амлодипин (2-[(2-аминоэтокси)метил]-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридин дикарбоновой кислоты 3-этил 5-метиловый эфир) — биологически активное вещество, широко применяющееся в медицинской практике. Относится к группе антагонистов кальция второго поколения, в организме связывается с дигидропиридиновыми рецепторами, блокирует кальциевые каналы, ингибирует трансмембранный переход ионов кальция внутрь клетки. Кроме того, амлодипин оказывает пролонгированное дозозависимое гипотензивное действие, обусловленное прямым расслабляющим влиянием на гладкие мышцы сосудов [1—3].

По физическим свойствам амлодипин (в форме безилата) — белый кристаллический порошок с температурой плавления 199—201 °С, малорастворимый в воде (растворимость в воде 75,3 мг/л при температуре 25 °С), умеренно растворим в 96% этаноле, легко в метаноле [1, 4].

Обладает выраженными токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам. Его LD₅₀ при внутрижелудочном введении лабораторным животным составляет 686 мг/кг [4]. В значительных дозах амлодипин может вызвать отравление различной степени тяжести [5, 6].

Отмечены многочисленные случаи летального исхода при отравлении амлодипином [7—10].

Широкое применение амлодипина в медицинской практике, его токсические свойства и наличие случаев смертельных отравлений делают его важным объектом судебно-химического анализа.

В химико-токсикологическом отношении амлодипин изучен недостаточно.

Цель работы — изучить особенности распределения амлодипина в организме теплокровных животных (крысы).

Исследовали амлодипин, соответствующий требованиям ФС 42−0214−07, c содержанием действующего вещества не менее 97%.

Провели исследования на 25 крысах (самцы породы Wistar массой от 220 до 240 г), которых разделили на 5 опытных групп, по 5 особей в каждой и содержали в течение 24 ч без пищи, давая им только воду. В аналогичных условиях содержали контрольную группу крыс, включающую 5 особей. В процессе исследования каждому животному опытных групп вводили через зонд в желудок амлодипин в виде водной суспензии (объем 4 мл) из расчета 686 мг вещества на 1 кг массы тела животного. Каждому животному контрольной группы вводили в желудок 4 мл воды.

После гибели животных их трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них амлодипина.

Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы.

Изолирование из внутренних органов и крови. Определенное количество мелкоизмельченных тканей органа или крови заливали двукратным по массе количеством ацетона. Смесь выдерживали 30 мин при периодическом перемешивании. Извлечение сливали с твердого остатка, процесс настаивания повторяли. Оба извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха при температуре 18—22 °С до незначительного (0,5—1,0 мл) объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка [11, 12].

Очистка полученных извлечений. Остаток, полученный после испарения ацетона из объединенного извлечения, растворяли в 2,0—2,5 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 100/160 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 120×10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 100/160 мкм. Содержимое колонки уплотняли путем равномерного постукивания по внешней поверхности ее стенок. Хроматографировали, используя подвижную фазу этанол-гексан (7:3). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая в отдельные пробирки. По 5—10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину типа Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах с внутренним объемом около 600 см³, используя подвижную фазу ацетон-бутанол (8:2). По наличию пятен на хроматограмме, величина R_f которых соответствовала таковой стандарта (0,56±0,04), определяли присутствие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие амлодипин (в стандартных условиях с 5-й по 10-ю, 9—20 мл), объединяли и упаривали вначале в токе воздуха при комнатной температуре до незначительного (0,5—1,0 мл) объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка. Остаток растворяли в 5 мл этанола (исходный раствор).

В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили по 0,5—2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель в токе азота до полного удаления растворителя.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном количестве этанола и количественно переносили на линию старта пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. Рядом на линию старта наносили 5—10 мкл раствора (в этаноле) вещества-свидетеля. Хроматографировали, используя элюент ацетон—бутанол (8:2). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Амлодипин идентифицировали по величине R_f.

В дальнейшем амлодипин элюировали из сорбента этанолом, идентифицировали по УФ-спектру и проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволновой полосы поглощения.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Участок хроматограммы с пятном исследуемого соединения вырезали, помещали в пробирку и элюировали вещество 5 или 10 мл этанола, периодически перемешивая содержимое пробирки в течение 10 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длины волны 200—380 нм. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В случае присутствия больших количеств анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом.

Идентификация методом ГХ/МС. Остаток в чашке № 2 растворяли в 2 мл метанола. Затем 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890 с масс-селективным детектором модели 5973 («Agilent Technologies», США). Пробу вводили без деления потока. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-1 MS (30 м×0,25 мм) со слоем неподвижной фазы (диметилполисилоксан) толщиной 0,25 мкм. Температура инжектора составляла 280 °C, интерфейса детектора 300 °C. Начальную температуру термостата колонки (80 °С) поддерживали в течение 1 мин, затем повышали до 250 °C со скоростью 40°C/мин, затем до 300 °C со скоростью 12,5 °C/мин. В качестве подвижной фазы использовали гелий, который подавался со скоростью 39 см³/мин. Время при конечной температуре 6 мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Диапазон сканирования 40—500 m/z. Анализируемое соединение идентифицировали по характерному времени удерживания, а также по совпадению масс-спектра с библиотечным (библиотека Wiley-7nl) на 86% и более.

При определении амлодипина сигнал регистрировали по полному ионному току с задержкой на растворитель в 1 мин.

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренной в области длины волны 240 нм, определяли количественное содержание амлодипинаспектрофотометрическим методом.

При идентификации методом ТСХ амлодипин проявлялся на хроматограммах в УФ-свете в виде темных розово-фиолетовых пятен на более светлом общем фоне пластины. Величина R_f анализируемого вещества (0,56±0,04) соответствовала величине R_f вещества-стандарта.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых вещества, извлеченного из биоматериала и очищенного по описанной схеме, и спектра чистого вещества в этаноле выявили совпадение форм спектральных кривых и положения точек экстремумов (рис. 1). Все спектральные кривые амлодипина имели две выраженные полосы поглощения с максимумами в области 240±2 и 363±2 нм.

При исследовании извлечений из тканей внутренних органов и крови крыс, не получавших амлодипина, установили отсутствие данного вещества в паренхиматозных и полых органах, а также в крови животных контрольной группы.

Измеренное при длине волны 240 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих анализируемому веществу, не превышало 0,032 единиц оптической плотности (ед. о.п.) для извлечений из органов и 0,022 ед. о.п. из крови в пересчете на 5 г того или иного вида биоматериала.

На рис. 2 и 3 представлены хроматограммы, полученные методом ГХ/МС, рассматриваемого соединения, выделенного из желудка и крови, в которых он обнаруживался в наибольших количествах.

Как свидетельствуют полученные данные, при идентификации методом ГХ/МС значение времени удерживания амлодипина совпадало со значением времени удерживания вещества-стандарта и составляло 10,47±0,14 мин.

На хроматограммах анализируемого соединения в области, соответствующей интервалу значений времени удерживания 9,50—11,50 мин, не обнаружили (по сравнению с хроматограммой вещества-стандарта) присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

В масс-спектрах исследуемого вещества, извлеченного из желудка и крови отравленных животных, присутствовали сигналы характерных осколков (заряженные частицы) для молекулы амлодипинас массами (m/z)44, 77, 120, 148, 165, 208, 236, 254, и 297, 347, 377. Основной ион 297 m/z (см. рис. 2 и 3).

Градуировочный график для спектрофотометрического определения амлодипина по интенсивности поглощения в среде этанола при длине волны 240 нм в данном случае описывался уравнением:

А = 0,040144•C + 0,014932,

где А — оптическая плотность; С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/ мл). Коэффициент корреляции более 0,99.

Относительная ошибка среднего результата при определении амлодипина методом УФ-спектрофотометрии не превышает 0,9% (n=6; p=0,95).

Результаты определения рассматриваемого соединения в органах и крови отравленных животных представлены в таблице. Как видно из данных таблицы, амлодипин присутствует в неизменном виде как в органах, так и в крови погибших организмов.

Наибольшие количества амлодипина (мг в 100 г органа или биожидкости) обнаруживаются в желудке (512,04±25,87), крови (40,01±2,78), почках (22,23±2,08), тонкой кишке (18,99±2,30) и мышцах (18,70±5,14), несколько меньшие — в содержимом желудка (14,16±1,63) и печени (8,27±0,60) отравленных животных.

1. Изучили распределение амлодипина в организме теплокровных животных (крысы) при введении LD₅₀ отравляющего вещества через желудок.

2. Вещество обнаруживается в значительных количествах в трупах погибших от отравления крыс в неизмененном виде.

3. Наибольшее количество амлодипина (мг/100 г) присутствует в ткани желудка (512,04±25,87), крови (40,01±2,78) и почках (22,23±2,08) отравленных организмов.

Конфликт интересов : авторы статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.