Расширение списка биологических объектов от живого лица для химико-токсикологического анализа является актуальной задачей научных исследований в области аналитической токсикологии. Одним из таких объектов могут стать волосы. Анализ волос расширяет возможности химико-токсикологических лабораторий по обнаружению наркотических средств, психотропных и других лекарственных веществ в организме человека. В предыдущей работе [1] показано, что волосы как объект химико-токсикологического исследования имеют ряд неоспоримых преимуществ: доступность объекта для забора, стабильность при хранении и возможность ретроспективной диагностики поступления в организм различных групп токсичных веществ.

Главной трудностью исследования волос является правильный подбор условий пробоподготовки для более полного извлечения токсикантов из внутренней части волоса. В соответствии со строением и спецификой образцов волос большинство исследователей выделяют несколько стадий пробоподготовки: отмывка (деконтаминация), извлечение веществ из образцов волоса, очистка полученных гидролизатов. Описанные в литературе [2—10] методы изолирования токсикантов можно разделить на несколько групп: экстракция органическим растворителем; экстракция органическими растворителями при пониженных температурах; термическое разложение объектов; щелочной или кислотный гидролиз с последующей жидкость-жидкостной экстракцией смесью растворителей; извлечение метанолом или подкисленным метанолом в ультразвуковой бане; ферментный гидролиз. Опыт работы с такими методиками показал их плохую воспроизводимость. Для исследования основных классов наркотических, психотропных и токсичных веществ некоторые авторы предлагают методики мягкого ферментативного разрушения волос с помощью таких ферментов, как β-глюкуронидаза, арилсульфатазы (glusulase), протеиназы К, протеазы E, протеазы VIII и биопураза.

Ферменты обладают определенной специфичностью, что позволяет использовать различные подходы к расщеплению полипептидных цепей для получения заданных наборов пептидов. Поиск новых ферментов, обладающих высокой специфичностью, ведется и в настоящее время [5]. Ранее была показана высокая эффективность применения ферментативного гидролиза для изолирования некоторых лекарственных веществ из крови и плазмы крови [11].

Правилами надлежащей лабораторной практики предписывается проводить валидацию всех используемых в лаборатории методик анализа. В связи с этим актуальным является валидация существующих методик пробоподготовки волос для диагностики наркотических и психотропных веществ [12].

Цель исследования — разработка методики изолирования токсических веществ из волос как объекта химико-токсикологического анализа на примере обнаружения производных барбитуровой кислоты с помощью ферментативного гидролиза и валидация разработанной методики.

Точная локализация токсичного вещества на белковой молекуле чаще всего неизвестна. Для проведения ферментативного гидролиза волос нами были выбраны ферменты животного происхождения: трипсин, химотрипсин, химопсин, и растительного происхождения: папаин как протеаза с низкой специфичностью. Они разрывают неограниченное число пептидных связей, чем можно добиться полноты извлечения токсиканта из объекта исследования [13].

Эксперименты проводили с использованием следующих реактивов: субстанция фенобарбитала (по ФС 42−2424−93), ферменты папаин (ЗАО «Вектон»), трипсин (ООО «Самсон-Мед»), химотрипсин (ООО «Самсон-Мед»), субстанция трилона Б (чда), субстанция цистеина. Применяли аппаратуру: вибрационную шаровую мельницу Retsch MM-200, настольную центрифугу HETTICH Rotanta 460 R, роторную мешалку Intelli — Mixer RM-1L, аналитические весы Sartorius СР224S, хроматограф с масс-селективным детектором Agilent 7890 A/5977 MSD на колонке HP — 5ms (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм), управление с помощью программы MassHunter GC MS. Полученные данные обрабатывали в программах MassHunter Qualitative Analysis и MassHunter Quantitative Analysis. Эксперименты проводили на лабораторных животных — белых беспородных крысах-самках линии Вистар, морских свинках-альбиносах (самцы, возраст около 6 мес, средняя масса 0,650 кг). Содержание и исследование животных осуществляли в соответствии с действующими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Перед началом и в ходе эксперимента животных содержали в стандартных условиях вивария на сбалансированной диете [14].

В течение 4 мес крысам ежедневно внутрижелудочно через зонд вводили 8,4 мг/кг раствора фенобарбитала, что соответствует суточной дозе для человека.

Морским свинкам в полость рта в течение 28 дней вводили заданный объем водного раствора фенобарбитала в дозе 5,3 мг/кг. Контрольные крысы ежесуточно получали воду в объеме 3 мл, морские свинки — 4 мл.

Отбор шерсти у подопытных животных производили 6-кратно каждые 28 дней со спины, правого и левого боков хирургическими ножницами максимально близко в коже. Полученные навески шерсти промывали от внешних загрязнений очищенной водой, затем 9 мл метанола до покрытия частиц биообъекта (однократно). Высушенные при комнатной температуре навески сначала измельчали ножницами до размера 3—5 мм, затем в шаровой мельнице до порошкообразной массы в режиме: 15 мин при 23 ГГц. Далее на аналитических весах отвешивали точную навеску со средней массой 0,4 г.

Метанол, полученный после промывки образца шерсти, анализировали в описанных далее условиях. В смывах фенобарбитал обнаружен не был.

Выполняли кислотный гидролиз по следующей методике: к навеске образца шерсти в пенициллиновом флаконе вместимостью 10 мл добавляли 4 мл 6 М раствора хлористоводородной кислоты, укупоривали и нагревали при температуре 37 °C в течение 12 ч в термостате. Гидролизат охлаждали, извлечение проводили методом жидкость-жидкостной экстракции при рН 2 среды. Экстрагировали 3 мл хлороформа 3 раза. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 500 мкл комплексного растворителя и исследовали методом газовой хроматографии на хроматографе Agilent 7890 A с масс-селективным детектором 5977 MSD. Пробы вводили автоматически. Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 0,8 мл/мин, температура испарителя 280 °C, температура интерфейса МС детектора 290 °C, температура колонки программируемая: начальная 80 °C в течение 0,4 мин, нагревание со скоростью 50 °С/мин до 100 °C, далее 30 °С/мин до 300 °C с выдержкой при конечной температуре 5 мин. Режим сканирования: по полному ионному току (SCAN) в диапазоне масс m/z 40—500 а.е.м. В газовый хроматограф автоматически с помощью автосамплера вводили 1 мкл исследуемого раствора в комплексном растворителе.

Количественное определение фенобарбитала в извлечениях проводили с помощью газовой хроматографии с масс-селективным детектированием, расчет вели по градуировочному графику, построенному по стандартным растворам субстанции фенобарбитала.

Ферментативный гидролиз химопсином, трипсином и химотрипсином выполняли в следующих условиях: раствор фермента готовили в соотношении фермент—шерсть животного (субстрат) 1:50. Навеску фермента растворяли в фосфатном буфере с рН 7,4 среды, затем термостатировали при температуре 37 °C в течение 3 ч. Полученные пробы центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин. Затем отбирали центрифугат. К осадку добавляли вторую порцию раствора фермента в равном объеме, перемешивали и термостатировали следующие 3 ч в аналогичных условиях. Затем данную операцию повторяли с 3-й порцией фермента химопсина. Общее время гидролиза составило 9 ч. К центрифугату добавляли 20% раствор серной кислоты до рН 2—3. Далее добавляли 3 мл хлороформа и перемешивали в течение 10 мин. Экстракцию хлороформом повторяли 3 раза порциями по 3 мл. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 500 мкл комплексного растворителя и исследовали методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием в условиях, описанных ранее.

Ферментативный гидролиз папаином выполняли в следующих условиях: готовили раствор фермента в соотношении фермент—субстрат 1:50. Навеску фермента растворяли в ацетатном буфере с рН 4,7, содержащим 0,1% раствор трилона Б и 0,1% раствор цистеина. Затем термостатировали при температуре 37 °C в течение 3 ч. Полученные пробы центрифугировали при 4600 об/мин в течение 10 мин; отбирали центрифугат. К осадку добавляли 2-ю порцию раствора фермента в равном объеме, перемешивали и термостатировали следующие 3 ч в аналогичных условиях. Данную операцию повторяли с 3-й порцией фермента папаина. Общее время гидролиза составило 9 ч. К центрифугату добавляли 3 мл хлороформа и перемешивали в течение 10 мин. Экстракцию хлороформом повторяли 3 раза порциями по 3 мл. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 500 мкл комплексного растворителя и исследовали методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием в условиях, описанных выше.

На хроматограммах (рис. 1, 2) наблюдали пик фенобарбитала со временем удерживания около 9 мин; на масс-спектрах присутствовал пик молекулярного иона m/z 232, основного иона m/z 204 и ионы m/z 117, 115, 161, 118, что совпадает с базой данных прибора и соответствует фенобарбиталу. Кроме того, на хроматограммах обнаружены пики таких эндогенных веществ, как фенилаланин, лимонная и тридекановая кислоты, L-тирозин и др. На хроматограмме не были обнаружены пики метаболитов фенобарбитала.

Ранее было показано, что методика гидролиза с использованием 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты не позволяет получить стабильно положительные результаты [15]. Исследование извлечения после проведения кислотного гидролиза 6 М раствором хлористоводородной кислоты в течение более короткого времени показало, что через 1 ч фенобарабитал обнаруживается в количестве 11,76±0,23 нг/мг объекта и существенного увеличения степени экстракции при проведении гидролиза в течение следующих 8 ч не происходит. Существенное увеличение степени экстракции наблюдалось только после 12 ч гидролиза, однако более продолжительный гидролиз уже не давал положительных результатов.

Полученные данные (табл. 1) по оценке эффективности применяемых на практике методов изолирования барбитуратов были статистически обработаны по методике, изложенной в Государственной фармакопее XIII издания (Р=90%) и ОСТ № 220 от 26.05.03 [16—19].

В соответствии с ОСТ № 220 от 26.05.03 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» были дополнительно определены следующие параметры: S (среднее квадратичное отклонение), составившее для метода кислотного гидролиза 1,08, и CV (коэффициент вариации), равный 3,65; для ферментативного гидролиза химопсином S=0,26 и CV=0,68, химотрипсином S=0,52 и CV=1,52, трипсином S=0,38 и CV=1,04, папаином S=0,88 и CV=2,14. Величины этих параметров соответствуют предельно допустимым значениям [19].

Методика количественного определения фенобарбитала была валидирована (табл. 2).

Валидация метода гидролиза химопсином, химотрипсином, папаином: 1. Сходимость — относительное стандартное отклонение (RSD) не превышало 30%. 2. Внутрилабораторная воспроизводимость — относительное стандартное отклонение (RSD) не превышало 4%. 3. Робастность — буферный раствор с определенным значением рН среды, соотношение субстрат/фермент температура и продолжительность инкубации.

1. Разработанная методика ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами может быть использована для разрушения связи токсичных веществ с белками в волосах для целей химико-токсикологического анализа.

2. Ферментативный гидролиз является более эффективным по сравнению с кислотным. После гидролиза химопсином (смесь трипсина и химотрипсина) фенобарбитала в извлечении найдено 38,51 нг/мг, после гидролиза химотрипсином — 41,45 нг/мг, после гидролиза папаином — 40,94 нг/мг. В извлечении после кислотного гидролиза раствором 6 М хлористоводородной кислоты фенобарбитал был определен в количестве 29,91 нг/мг.

3. Ферментативный гидролиз позволяет получить более чистое извлечение, чем кислотный гидролиз. На хроматограмме отмечается меньшее количество пиков соэкстрактивных веществ.

4. Ферментативный гидролиз проходит в более мягких условиях по сравнению с кислотным, что может быть использовано для изолирования легкогидролизуемых токсичных веществ.

5. Ферментативный гидролиз занимает меньше времени (3—9 ч) по сравнению с кислотным (12—14 ч).

6. Для разработанной методики определены валидационные характеристики: сходимость, внутрилабораторная воспроизводимость и робастность.

Конфликт интересов: авторы статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.