Натрия оксибутират (натриевая соль γ-оксимасляной кислоты, натриевая соль 4-оксибутановой кислоты, натрия оксибутират, натрия оксибат) — одно из самых интересных и сложных веществ при интерпретации результатов его определения в биологическом материале.

Впервые γ-оксимасляная кислота (ГОМК, 4-оксибутановая кислота) синтезирована в 1874 г. русским химиком-органиком А. Зайцевым [1]. Методика синтеза была опубликована в 1929 г. Это вещество не вызывало у исследователей особого интереса, пока французский фармаколог А. Лабори не занялся изучением его биологической роли. Результатом его исследований стало внедрение натрия оксибутирата в клиническую, а с 1960 г. — в анестезиологическую практику. ГОМК не может проникать через гематоэнцефалический барьер; эту способность ей придает форма натриевой соли [2].

Натрия оксибутират применяется в клинической практике более 50 лет, но представления о точном механизме его действия противоречивы. Предполагают, что основной механизм выключения сознания состоит в блокировании передачи на постсинаптическом уровне в ядрах ретикулярной формации и прямом торможении активности коры головного мозга. Натрия оксибутират оказывает транквилизирующее и снотворное действие. Анальгетические свойства слабые. Засыпание происходит плавно, без стадии возбуждения. Вещество в целом оказывает противосудорожное действие. Натрия оксибутират обладает выраженными системными антигипоксическими, радиопротекторными свойствами, повышает устойчивость к ацидозу и гипотермии. Он стимулирует выделение соматотропного гормона роста, являясь одним из мощнейших на сегодняшний день стимуляторов гипофиза [3]. До начала 90-х годов XX века ГОМК продавалась (в частности, в США) как биологическая добавка для формирования мышечной массы [4].

В Государственный реестр лекарственных средств РФ в настоящее время включена одна лекарственная форма натрия оксибутирата — раствор для внутривенного или внутримышечного введения в концентрации 200 мг/мл. В России натрия оксибутират разрешен для применения в анестезиологии как неингаляционный гипнотик, особенно у пациентов с выраженной эндогенной интоксикацией, гипоксией любой этиологии, и в акушерской практике. Возможно также сочетание с любыми ингаляционными и внутривенными анестетиками. Натрия оксибутират применяется в наркологической практике для лечения алкоголизма, купирования абстинентного синдрома и похмелья. В данном качестве он используется в Италии и Австрии [5, 6].

В Российской Федерации оксибутират (4-гидроксибутират натрия) и другие соли γ-оксимасляной кислоты включены в список психотропных веществ, оборот которых ограничен (Список III Постановления Правительства Р.Ф. № 681 от 30.06.98). Включение натрия оксибутирата в список контролируемых веществ объясняется его немедицинским употреблением наркозависимыми лицами, прежде всего молодежью. На уличном сленге оксибутират натрия известен как «Буратино», «Бутират», «Гомк», «Бутик» и т. д. Действие препарата сравнимо с действием наркотических средств амфетаминового ряда. При употреблении малых доз достигается эффект, подобный слабому алкогольному опьянению. Средние дозы способствуют усилению релаксации, отмечается повышенная чувствительность к музыке, желание танцевать. Высокие дозы препарата вызывают сон [7].

C конца 90-х годов натрия оксибутират становится популярным клубным наркотиком, часто в сочетании с этанолом, кокаином, метамфетамином, экстази и кетамино [4]. Относится к «наркотикам изнасилования» (в англ. литературе «rape drugs», в случае изнасилований с предшествующим приемом алкоголя, фармакологических и запрещенных препаратов — «drug facilitated sexual assault — DFSA» — сексуальное насилие, облегчаемое наркотиками), так как позволяет подавить контроль жертвой своего поведения, облегчить совершение сексуального насилия [8]. Отдельной проблемой во многих странах является употребление натрия оксибутирата водителями автомобилей из-за отсутствия запаха алкоголя, быстрого выведения из крови при сходном с алкогольным характере опьянения. Типичным поведением водителя, находящегося под действием натрия оксибутирата, являются хаотичное вождение (перестроение, игнорирование дорожных знаков), аномальное поведение (засыпание на красный свет светофора, остановка посередине дороги), дезориентация в пространстве, замедленная речь [9].

Натрия оксибутират употребляют перорально (пьют) или вводят внутривенно медленно 1—2 мл/мин [7].

Для достижения наркотического эффекта возможно употребление экзогенных прекурсоров ГОМК: γ-бутиролактона (ГБЛ) и 1,4-бутандиола, представляющих собой органические растворители, используемые в различных областях промышленности. Они конвертируются в организме в ГОМК в течение примерно 1 мин [10]. Их фармакологические и поведенческие эффекты на организм определяются ГОМК, которая является целевым аналитом при проведении химико-токсикологических (судебно-химических) исследований.

Токсикокинетика. Натрия оксибутират быстро всасывается после перорального приема, максимум концентрации в крови достигается через 20—40 мин. Связывание с белками плазмы составляет менее 1%. При терапевтических концентрациях период полувыведения 30—50 мин. ГОМК метаболизируется ферментами печени с образованием конечных продуктов диоксида углерода и воды; активных метаболитов ГОМК не образует.

ГОМК является эндогенным продуктом метаболизма, и его следовые количества присутствуют в тканях и жидкостях здоровых людей, не употреблявших ГОМК. По представленным в литературе результатам исследований, эндогенная ГОМК в моче живых лиц составляет 0,5—2 мг/л и в редких случаях больше, но не превышает 5 мг/л; в крови живых лиц от 0,17 до 1,51 мг/л [11, 12]. Наличие эндогенной ГОМК в биологических объектах требует обязательного установления уровня концентрации (cut-off), ниже которой результат определения ГОМК должен считаться эндогенным и не расцениваться как факт приема оксибутирата. В биообъектах от живых лиц количество эндогенной ГОМК в моче выше, чем в крови. Для посмертных объектов наблюдается обратная закономерность — содержание эндогенной ГОМК в крови выше, чем в моче. Следовательно, для анализа прижизненных и посмертных биообъектов должны использоваться разные значения cut-off для ГОМК. Для биообъектов от живых лиц предлагают следующие значения cut-off: для крови — 5 мг/л и для мочи — 10 мг/л [13—15]. На данный уровень cut-off не влияют рН мочи, индекс массы тела, раса [16], пол, курение, прием алкоголя [17], сахарный диабет, беременность [18]. Во всех случаях эндогенная концентрация ГОМК ниже предложенных пороговых значений.

Количество эндогенной ГОМК в посмертных объектах выше, чем в прижизненных. Исследователи из Японии предположили механизм новообразования ГОМК в посмертных объектах из тетраметилдиамина — продукта посмертного распада белка. Молекула амина конвертируется в 4-амино-бутилальдегид с последующим окислением в ГОМК [19]. Для посмертных объектов в литературе предлагаются следующие значения cut-off: для мочи 20 мг/л и для крови 30—50 мг/л [20, 21] (30 мг/л для периферической крови и 50 мг/л для крови из полости сердца) [22]. По данным литературы [23], содержание ГОМК в посмертных объектах увеличивается при хранении объектов в условиях холодильника в течение 4 мес, но все равно не превышает пороговых концентраций 20 мг/л для мочи и 30 мг/л для крови.

R. Baselt [24] приводит следующие данные по дозам оксибутирата натрия: 10 мг/кг вызывает амнезию, 20—30 мг/кг — сон, 50 мг/кг и более — наркоз. При пероральном приеме 25 мг/кг натрия оксибутирата наблюдали содержание ГОМК в крови 80 мг/л через 0,5 ч и 75—90 мг/л через 2 ч. В случае внутривенного введения 50 мг/кг натрия оксибутирата количество ГОМК в крови составляет 170 мг/л через 15 мин. Содержание в крови 360 мг/л ГОМК соответствуют глубокому сну, 156—260 мг/л — управляемому сну, 56—156 мг/л — легкому сну и менее 52 мг/л — пробуждению от сна.

Данные о концентрации ГОМК в крови лиц, употреблявших натрия оксибутират с немедицинской целью, в доступной литературе многочисленны и разнообразны. Это объясняется быстрым выведением ГОМК из крови, различными временны́ми периодами при отборе проб в каждом конкретном случае и дозой принятого натрия оксибутирата. A. Jones и соавт. [25] приводят данные по определению концентрации ГОМК в крови 584 водителей: диапазон концентраций ГОМК составил 8—340 мг/л. По данным другого исследования [26], диапазон концентраций ГОМК составил 80—190 мг/л.

Количество ГОМК в посмертных биологических объектах может достигать очень высоких значений. По данным D. Zvosec и соавт. [27], при анализе 60 смертельных отравлений натрия оксибутиратом концентрация ГОМК составила в среднем 561 мг/л (диапазон от 66 до 4400 мг/л).

D. Lenz и соавт. [28] приводят данные о содержании ГОМК и γ-бутиролактона (ГБЛ) в биообъектах мужчины 38 лет, погибшего от передозировки ГБЛ. Содержание ГОМК составило: 1052 мг/л (сердечная кровь), 932 мг/л (венозная кровь), 711 мг/кг (головной мозг), 1245 мг/кг (легкие), 1080 мг/кг (печень), 1668 мг/кг (почки), 954 мг/л (моча), 2942 мг/кг (желудок), а ГБЛ: 31 и 21 мг/л; 95, 61, 112, 458 мг/кг, 54 мг/л и 9528 мг/кг соответственно.

Наиболее полный обзор аналитических методов определения ГОМК в биологических объектах представлен в работе A. Ingels и соавт. [29]. В зарубежных источниках [30, 31] приводятся данные об успешном использовании энзимных методов обнаружения ГОМК в крови и моче, что значительно облегчает задачи скрининговых анализов биопроб на присутствие ГОМК. Стандартными методами определения ГОМК в биологических объектах остаются методы газовой хроматографии с плазменно-ионизационным и масс-селективными детекторами [32]. Применение газожидкостной и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией оправдано при анализе так называемых альтернативных объектов: волосы, пятна крови и т. д., в которых содержание ГОМК заведомо низкое. Для скрининговых судебно-химических исследований посмертных биологических жидкостей и биотканей метод газовой хроматографии с одноквадрупольным масс-селективным детектором (ГХ-МС) является адекватным выбором.

Цель исследования — разработка и внедрение в практику работы судебно-химического отделения СПб ГБУЗ БСМЭ методики судебно-химического анализа посмертных биообъектов для определения ГОМК в биологических объектах.

В экспериментах использовали газовый хроматограф с масс-селективным детектором МАЭСТРО 7820А-5975, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5МS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки 0,25 мкм.

Условия детектирования: энергия электронов ионизации 70 эВ; регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования в интервале масс 40—500 а.е.м.

Управление прибором и сбор данных осуществляли с помощью программного обеспечения MSD ChemStation, обработку результатов и анализ данных — в DataAnalysis и АМDIS.

Режим хроматографирования: скорость газа-носителя 0,8 мл/мин; задержка включения детектора 9 мин после ввода пробы; температура инжектора 280 °C, интерфейса 280 °C, температура колонки программируемая — начальная 60 °C (1 мин), затем нагревание колонки со скоростью 5 °С/мин до 100 °C с выдержкой при конечной температуре 15 мин.

Кроме того, использовали центрифугу Liston C 2201, вибрационный встряхиватель IKA VXR basicVibrax, Вортекс Elmi V-3, бутилацетат марки «Ч», натрия оксибутират раствор для внутривенного и внутримышечного введения 200 мг/мл (ФГУП «Московский эндокринный завод»), тимол марки «для аналитики», BSTFA + TMCS 99:1 (фирмы SUPELCO).

Для разработки методики использовали донорскую кровь и образцы свиной печени.

При пробоподготовке биологических объектов для определения токсикантов учитывали их физико-химические свойства и особенности биологической матрицы.

Натрия оксибутират — белый или белый со слабым желтоватым оттенком кристаллический порошок со слабым специфическим запахом, легко растворим в воде, растворим в этаноле. ГОМК — кристаллический порошок, легко растворим в воде. Водные растворы имеют слабощелочную реакцию среды.

По данным литературы [33—36], изолирование ГОМК из биообъектов можно проводить методами жидкость-жидкостной экстракции — ЖЖЭ (экстрагенты — этилацетат, ацетон, ацетонитрил) и твердофазной экстракции — ТФЭ. ЖЖЭ — самый распространенный метод экстракции токсикантов из биообъектов при проведении судебно-химических исследований, так как позволяет экстрагировать широкий спектр токсикантов и имеет значительно более низкую стоимость по сравнению с методами ТФЭ. Особенностью ГОМК и натрия оксибутирата является их высокая растворимость в воде и органических растворителях. При проведении пробоподготовки биообъектов для определения ГОМК необходимо учитывать, что при рН <5,0 ГОМК циклизуется с образованием бутиролактона. На этом свойстве ГОМК основан ряд методик определения ГОМК в виде бутиролактона [37].

Идентификация токсикантов в виде других соединений при судебно-химических исследованиях в большинстве случаев затрудняет интерпретацию полученных результатов и вызывает ряд дополнительных вопросов по наличию исходных соединений в биологических пробах. Именно поэтому в качестве метода изолирования выбрали ЖЖЭ бутилацетатом без изменения рН биологических объектов для изолирования нативной ГОМК. Применение бутилацетата в качестве экстрагента обосновано следующим:

1) бутилацетат легче воды, следовательно, органическая фаза после экстракции будет находиться над пробой биожидкости, что значительно облегчает отбор органической фазы для дальнейшего анализа;

2) растворимость бутилацетата в воде 1%, этилацетата 12%. При проведении экстракции меньшая растворимость экстрагента в воде, следовательно, и в биологических жидкостях приведет к более воспроизводимым результатам. Меньшее содержание воды в пробе значительно повышает качество анализа методом хромато-масс-спектрометрии;

3) бутилацетат имеет более высокие предельно допустимые концентрации (ПДК) в рабочей зоне (200 мг/м³), чем ацетонитрил (10 мг/м³), хлороформ (5 мг/м³), и, следовательно, более низкую токсичность, что важно для обеспечения наиболее безопасных условий труда в лаборатории при производстве большого объема скрининговых исследований.

Анализ биологических объектов имеет смысл только при определении количественного содержания ГОМК. В связи с этим в пробу в процессе пробоподготовки сразу добавляют внутренний стандарт (тимол). В данном качестве (для количественного определения ГОМК) он отвечает всем основным требованиям, предъявляемым к внутреннему стандарту:

1) не является эндогенным веществом и не содержится в биологических пробах (случаи определения тимола в биопробах исключительные);

2) имеет близкие физико-химические свойства к целевому аналиту (изолируется из биоматериала по той же методике, что и аналит);

3) подвергается дериватизации (определение ГОМК методом хромато-масс-спектрометрии возможно только в виде дериватов из-за высокой полярности соединения);

4) имеет близкие хроматографические свойства (относительно близкое время удерживания на хроматографических колонках);

5) устойчив в виде растворов.

Пробоподготовка крови и мочи: флакон с кровью (мочой) встряхивали на Вортексе до достижения гомогенности (данная стадия пробоподготовки обязательная, так как концентрация ГОМК в сыворотке крови выше, чем в цельной крови). Это объясняется хорошей растворимостью ГОМК в крови и, следовательно, более высокой концентрацией ГОМК в биообъектах с большим содержанием воды. Соотношение концентраций ГОМК сыворотка/кровь 1,23:1 [37].

Механическим дозатором отбирали 1 мл крови (мочи) и помещали в центрифужную стеклянную пробирку. К пробам крови добавляли 300 мкл воды и встряхивали на Вортексе в течение 3 с, посмертная кровь может содержать меньшее количество воды; добавление воды в пробу позволяет получить более жидкую пробу, что повышает эффективность экстракции ГОМК. Затем добавляли 50 мкл раствора тимола в бутилацетате в концентрации 41,6 нг/мкл. Встряхивали на Вортексе в течение 3 с. Экстрагировали 250 мкл бутилацетата с использованием встряхивателя VXRbasicVibrax в течение 10 мин при 1000 об/мин. Центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин. Верхний слой органического растворителя в количестве 100 мкл отбирали дозатором и переносили в виалу для автосамплера. Добавляли 100 мкл BSTFA + 1% TMCS. Виалу закрывали, термостатирвали 30 мин при температуре 80 °C. После охлаждения пробу анализировали методом хромато-масс-спектрометрии.

Пробоподготовка биотканей: 3 г биоткани мелко измельчали, перемешивали, отбирали навеску 1 г в стеклянную пробирку. Заливали 1 мл очищенной воды, встряхивали на Вортексе при 2000 об/мин в течение 3 с. Экстрагировали с использованием встряхивателя VXRbasicVibrax в течение 10 мин. Водный слой (0,5 мл) отбирали дозатором в стеклянную центрифужную пробирку, добавляли 50 мкл раствора тимола в бутилацетате в концентрации 41,6 нг/мкл. Встряхивали на Вортексе в течение 3 с. Экстрагировали 250 мкл бутилацетата с использованием встряхивателя VXRbasicVibrax в течение 10 мин при 1000 об/мин. Центрифугировали при 3500 об/мин 10 мин. Верхний слой органического растворителя в количестве 100 мкл отбирали дозатором и переносили в виалу для автосамплера. Добавляли 100 мкл BSTFA+1% TMCS. Виалу закрывали, термостатировали 30 мин при температуре 80 °C. После охлаждения пробу анализировали методом хромато-масс-спектрометрии.

Идентификацию ГОМК проводили в виде 2TMS-4-оксибутановой кислоты по времени удерживания и соответствию библиотечному масс-спектру. Масс-спектр 2ТМС-4-оксибутановой кислоты: 147 999; 73 544; 75 249; 117 235; 233 179; 148 162; 45 138; 14 989; 4178; 14 370. Масс-спектр ТМС-тимола: 207 999; 73 852; 222 265; 208 196; 45 156; 91 100; 7587; 7481; 4078; 9667. Масс-спектры 2ТМС-4-оксибутановой кислоты и ТМС-тимола имеются в библиотеках NIST, Willey. Время удерживания 2TMS-4-оксибутановой кислоты 17,050. Время удерживания ТМС- тимола 23,438.

Определенные сложности при идентификации ГОМК в моче представляет эндогенное вещество — мочевина. Мочевина экстрагируется из мочи в процессе ЖЖЭ и образует 2ТМС-мочевину при проведении дериватизации проб. Масс-спектр 2ТМС-мочевины: 147 999; 186 630; 73 300; 74 180; 148 170; 75 150; 190 120; 146 110; 4590; 6690. У 2ТМС-мочевины и 2ТМС-4-оксибутановой кислоты одинаковый характеристический ион — m/z 147. В случае неразделения пиков 2ТМС-мочевины и 2-ТМС-4-оксибутановой кислоты при хроматографической разгонке одинаковый характеристический ион будет искажать результат количественного определения 4-оксибутановой кислоты. На рисунке

Для количественного определения (путь построения градуировочных графиков) использовали кровь, мочу, печень, заведомо не содержащие ГОМК (контроль проводился методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором). К пробам крови, мочи и печени добавляли раствор оксибутирата в воде. Диапазон концентраций 26,4—1321,6 мг/л. Пробоподготовку проводили, как описано ранее для крови, мочи и внутренних органов. Градуировочный график строили по 7 точкам, соответствующим концентрации оксибутирата в крови, моче и внутренних органах: 26,4; 66,3; 132,16; 264,32; 330,4; 660,8 и 1321,6 мг/л. При расчетах концентраций для построения градуировочного графика использовали коэффициент пересчета натрия оксибутирата в 4-оксибутановую кислоту (0,826). Содержание оксибутирата в биологических объектах определяли методом внутреннего стандарта. Внутренний стандарт — раствор тимола в бутилацетате в концентрации 41,6 нг/мкл.

Метрологические характеристики. Предел обнаружения ГОМК в крови, моче и внутренних органах 10 мг/л, предел количественного определения 26 мг/л. Коэффициент корреляции графиков более 0,999. Среднее квадратичное отклонение 13,1. Относительное стандартное отклонение 4,4% (для концентрации ГОМК 330,4 мг/л).

В 2017 г. в СПб ГБУЗ БСМЭ выполнены 25 исследований биологических объектов для определения ГОМК. Диапазон определяемых концентраций ГОМК в крови составил от 26,4 до 3361,1 мг/л. Соотношение концентрации ГОМК в крови и моче следующее: 1) 903,3 мг/л (кровь) и 20,95 мг/л (моча); 2) 3210,1 мг/л (кровь при разведении 1:5) и 1163,5 мг/л (моча); 3) 3361,1 мг/л (кровь при разведении 1:5) и 18354,9 мг/л (моча при разведении 1:10); 4) 1017,5 мг/л (кровь) и 1322,1 мг/л (моча при разведении 1:1). Концентрация ГОМК во внутренних органах не превышала 600 мг/л, а в печени всегда была значительно выше, чем в почке. Следует отметить, что в 4 случаях при исследовании биоматериала совместно с ГОМК обнаружили метадон, в 3 — фенобарбитал, в 2 — амфетамин и по 1 случаю ГОМК совместно с α-PVP и метамфетамином.

1. Определение ГОМК в биологических объектах — актуальная задача современной аналитической токсикологии.

2. Предложенная методика количественного определения ГОМК основана на методе хромато-масс-спектрометрии, являющемся в настоящее время основным методом идентификации токсикантов при производстве судебно-химических исследований; она предназначена для широкого круга лабораторий.

3. Методика пробоподготовки биологических объектов позволяет проводить скрининговые анализы биопроб в достаточно большом объеме, а малые объемы используемых реактивов снижают материальные затраты на производство исследований.

4. В связи с быстрым выведением ГОМК из крови для установления факта употребления натрия оксибутирата необходимо анализировать несколько биологических объектов (моча живых лиц, биоткани при смертельных исходах), особенно в случаях длительного (несколько часов) интервала между предполагаемым приемом вещества и временем отбора проб.

5. Судебно-химические (химико-токсикологические) исследования для определения ГОМК необходимо проводить с количественной оценкой содержания ГОМК в биоматериале.

6. Определение ГОМК в биологических объектах может свидетельствовать о приеме не только натрия оксибутирата, но и γ-бутиролактона и 1,4-бутандиола.

7. При интерпретации результатов судебно-химических (химико-токсикологических) исследований следует учитывать эндогенные концентрации ГОМК в прижизненных и посмертных объектах.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2e-mail: sudmed@zdrav.spb.ru; https://orcid.org/0000-0002-8896-6242