В последние несколько лет в городах России отмечается всплеск отравлений домашних собак, которые приписывают так называемым догхантерам (дословно — охотники за собаками). Разбросанные на улицах города отравленные приманки представляют потенциальную угрозу не только для животных. Средства, применяемые догхантерами, разнообразны. Приманки часто многокомпонентные: их состав постоянно меняется и совершенствуется. На форумах догхантеров упоминаются такие вещества, как гидрохинон, ДДТ (дихлордифенилтрихлорэтан), некоторые алкалоиды (хинин, эфедрин, стрихнин), рицин, токсины бледной поганки. Нестероидные противовоспалительные средства, антидепрессанты, противотуберкулезные, противоопухолевые препараты, производные витамина D, бензодиазепины, β-адреноблокаторы — любой препарат в высоких дозах может нанести серьезный вред организму и вызвать отравление [1]. По характерной картине отравления, с учетом данных предварительных исследований и информации на форумах догхантеров, установили, что одна из разновидностей приманок содержит изониазид и метоклопрамид.

Производные гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК) — это группа синтетических противотуберкулезных препаратов первого ряда, угнетающих синтез миколовых кислот клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis. Вещества данной группы, широко применяемые в длительных курсах терапии при всех формах туберкулеза у человека, по своей природе являются синаптотропными ядами, действие которых опосредовано метаболитами. Основной путь биотрансформации, протекающей с образованием гепато- и нейротоксичных агентов — ацетилирование: при участии ацетилтрансферазы образуется N-ацетилизониазид, который впоследствии превращается в изоникотиновую кислоту и моноацетилгидразин [2]. Нейротоксическое действие изониазида обусловлено снижением содержания пиридоксина в плазме крови и тканях [3]. Интоксикация производными ГИНК может привести к тяжелым необратимым нарушениям в организме человека вплоть до летального исхода. В судебно-медицинской практике известны случаи отравления изониазидом в суицидальных целях и по неосторожности [4]. Для некоторых животных, в частности собак, препараты данной группы представляют смертельную угрозу даже в низких дозах.

Помимо активного вещества, обладающего прямым токсическим действием для собак, приманки могут содержать вспомогательные компоненты, которые напрямую либо косвенно усиливают повреждающее действие токсиканта. Для предупреждения рвотного рефлекса, возникающего у собаки в связи с потенциальной токсической угрозой, злоумышленники добавляют в приманки противорвотное средство метоклопрамид. По механизму действия он относится к антагонистам дофаминовых (D₂), а в высоких дозах — и серотониновых (5-НТ₃) рецепторов. Метоклопрамид не обладает ярко выраженной токсичностью [5]. У животных отмечается хорошая переносимость препарата. Согласно данным ветеринарного справочника, его не следует назначать животным, склонным к судорогам [6].

Цель исследования — разработка методики изолирования и определения изониазида и метоклопрамида в приманках, используемых для отравления домашних животных, а также в биологических жидкостях (моча) при проведении исследований в судебно-химических отделениях бюро судебно-медицинской экспертизы и химико-токсикологических лабораториях при подозрении на отравление данными веществами.

Использовали следующее оборудование: газовый хроматограф фирмы «Hewlett Packard» (США) модели Agilent Technologies 7890А с автоинжектором 7693 и масс-селективным детектором 5975С; высокоэффективный жидкостный хроматограф Waters 2695 c ультрафиолетовым детектором 2996; установку для твердофазной экстракции Waters и патроны для твердофазной экстракции марки Oasis HLB. В исследованиях применяли субстанции изониазида марки ЧДА; таблетки изониазида 0,3 г производства ОАО «Акрихин» (Россия); таблетки церукала 10 мг производства ООО «Тева» (Израиль); раствор церукала для инъекций 0,5% производства «AWD Pharma GmbH» (Германия). Приманки, обнаруженные в нескольких районах Санкт-Петербурга, представляли собой куски сосисок, колбасы или фарша различного размера с посторонними включениями в виде таблеток, крупинок или порошкообразной массы. Лабораторные животные — две белые беспородные крысы-самки линии Wistar, массой 0,235 и 0,223 г. Содержание и исследование животных осуществляли в соответствии с действующими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [7]. Перед началом и в ходе эксперимента животных содержали в стандартных условиях вивария на сбалансированной диете.

Эксперимент. Посторонние включения из приманок в виде размоченных белых таблеток и белой порошкообразной массы отбирали в химический стакан вместимостью 100 мл, растворяли в воде очищенной, подщелачивали 25% раствором аммиака до рН 8,0—9,0 и извлекали универсальным экстрагентом состава дихлорметан/дихлорэтан/гептан/изопропанол в соотношении 2:2:2:1,5. Органическую фазу отбирали в виалу, выпаривали в токе воздуха до объема 500 мкл. Исследование проводили методом ГХ-МС: капиллярная колонка с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м (HP-5MS); газ-носитель гелий, скорость потока 1 мл/мин; температура инжектора 260 °C, интерфейса 290 °С. Температура колонки: начальная 75 °C в течение 1,2 мин, прогрев до 100 °C со скоростью 50 °C/мин; затем прогрев до 290 °С со скоростью 20 °C/мин; выдержка при конечной температуре 8,3 мин. Масс-селективный детектор с температурой источника 230 °C; масс-квадрупольный анализатор; энергия ионизации 70 эл/в. Режим работы испарителя split/splitless без деления потока. Время задержки растворителя 3,7 мин после ввода пробы. Регистрация масс-спектров в режиме Scan полного сканирования ионов в интервале масс 42—450 а.е. На хроматограммах наблюдали два пика со временем удерживания 7,05 и 12,18 мин (рис. 1).

В литературе отсутствует информация о методиках изолирования и определения содержания метоклопрамида в объектах биологического происхождения. Представлены только некоторые реакции с осадительными и цветными реактивами, а также данные спектрофотометрии для фармацевтической субстанции [5, 8, 9].

Для определения изониазида в биологических объектах (кровь, плазма крови) в целях улучшения хроматографических свойств и повышения чувствительности анализа ряд авторов [5, 10] предлагают проводить реакцию дериватизации с помощью 4-гидроксибензальдегида, коричного, салицилового альдегида, 5-метилфуран-2-карбоксиальдегида, пропионового альдегида или 2-флюоренкарбоксиальдегида для последующего анализа супернатанта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Для разработки методики изолирования изониазида и метоклопрамида из приманок и биологических жидкостей животных готовили модельные растворы веществ: изониазид с содержанием 400 мкг/мл из субстанции ЧДА; метоклопрамид в концентрации 100 мкг/мл из таблетки церукала. Концентрации веществ подбирали в соответствии с терапевтическими дозами для человека и учетом биодоступности в организме.

Жидкость-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) исследуемых веществ проводили по описанной ранее методике с универсальным экстрагентом. Органическую фазу отбирали в виалу, выпаривали в токе воздуха. Затем сухой остаток растворяли в смеси ацетонитрила сорта 0 с водой, деионизованной в соотношении 60:40, после чего определяли количественно вещества методом ВЭЖХ в следующих условиях: прибор Waters 2695 с колонкой Symmetry C18 размером 5 мкм 3,9×150 мм, температура колонки 30 °C; УФ-детектор с длиной волны 261 нм; объем вводимой пробы 10 мкл; режим подачи элюентов изократический. Подвижная фаза — ацетонитрил/вода деионизованная (60:40). Скорость подачи подвижной фазы 500 мкл/мин. На хроматограмме отмечали пики со временем удерживания 2,2 мин для изониазида и 2,05 мин для метоклопрамида (рис. 4, 5).

Содержание веществ в извлечениях рассчитывали по градуировочному графику соответственно изониазида и метоклопрамида. Затем модельные растворы последовательно подвергали экстракционному вымораживанию по следующей методике [11, 12]: к 4 мл раствора добавляли 4 мл ацетонитрила, перемешивали и помещали в морозильную камеру (температура от –18 до –22 °С). После образования в нижней части флакона фазы льда верхний слой ацетонитрила сливали. К ледяной части пробы после размораживания при комнатной температуре 3 раза добавляли по 2 мл ацетонитрила, перемешивали, помещали в морозильную камеру. Объединенные извлечения выпаривали в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 1 мл ацетонитрила и вводили в инжектор хроматографа.

Исследуемые вещества экстрагировали из модельных растворов методом твердофазной экстракции (ТФЭ) на патронах HLBOasis: патроны последовательно промывали 1 мл метанола и 1 мл воды очищенной, затем загружали 1 мл анализируемого модельного раствора. Перед извлечением патроны промывали 1 мл 5% раствором метанола и элюировали 1 мл метанола. Элюат выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в смеси ацетонитрила сорта 0 с водой деионизованной в соотношении 60:40, после чего определяли количественно вещества методом ВЭЖХ в указанных условиях.

Разработанную методику апробировали на биологическом материале лабораторных животных. Концентрацию изониазида и метоклопрамида для введения животным рассчитывали исходя из терапевтических доз веществ для человека в пересчете на крысу. Готовили растворы изониазида и метоклопрамида в 50 мл воды очищенной, последовательно растворяли одну таблетку изониазида 0,3 г и 2 таблетки церукала по 10 мг. Осадок отфильтровывали и отбирали шприцем 3,13 мл полученного раствора, содержащего 18,8 мг изониазида и 1,24 мг метоклопрамида. Приготовленные модельные растворы вводили животным внутрижелудочно через зонд однократно. Собирали суточную мочу — 7,5 мл. Экстракцию веществ из мочи проводили по описанным ранее методикам.

Полученные данные о степени экстракции изучаемых веществ статистически обработали по методике, изложенной в ГФ XIII и ОСТ № 220 от 26.05.03 «Правила проведения внутрилабораторного контроля лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» [13, 14] (см. таблицу).

Степень извлечения изониазида методом прямой ЖЖЭ из модельного водного раствора при количественном определении методом ВЭЖХ составила всего 3,3±0,2%, ошибка 11,6%, коэффициент вариации (CV) 5,7%. Величина пиков проб метоклопрамида в извлечениях из модельных растворов, полученных с помощью прямой ЖЖЭ, была на уровне чувствительности прибора и оказалась недостаточной для количественной оценки.

Степень экстракции изониазида из модельного раствора методом экстракционного вымораживания составила 9,0±0,9%, ошибка 10,6%, CV=4,9%, а степень экстракции метоклопрамида из модельного раствора таблетки методом экстракционного вымораживания 26,1±0,7%, ошибка 5,6%, CV=2,6%.

Проведенные ранее исследования [15] показали, что твердофазная экстракция (ТФЭ) как метод пробоподготовки — высокоэффективный, сочетающий элементы экстракции и очистки. Настоящее исследование проводили на патронах Oasis HLB, которые обладают липофильно-гидрофильной двойственностью и вследствие этого способны оставаться увлажненными водой, что значительно упрощает работу с ними и делает выход и воспроизводимость постоянными. Отличительным свойством патронов является их способность удерживать широкий спектр полярных и неполярных молекул.

Степень экстракции изониазида из модельного раствора методом ТФЭ составила 53,6±2,5%, ошибка 10,3%, CV=4,8%, а степень экстракции метоклопрамида 72,9±2,9%, ошибка 4,1%, CV=1,9%. На основании полученных данных можно считать ТФЭ высокоэффективным способом пробоподготовки исследуемого вещества. Для ТФЭ изучаемых веществ из модельных растворов были определены некоторые валидационные характеристики. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 4,3% для изониазида и 1,7% для метоклопрамида, что соответствует критериям приемлемости.

Экстракцию исследуемых веществ из мочи лабораторных животных проводили методом ТФЭ по описанной ранее методике. По результатам четырех измерений концентрация изониазида в моче составила 198,3 мкг/мл, метоклопрамида — 421,3 мкг/мл.

На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод о неэффективности ЖЖЭ для извлечения изониазида (3,3±0,2%) и метоклопрамида из биологической жидкости (моча). Метод экстракционного вымораживания, предложенный отечественными исследователями в качестве альтернативы ЖЖЭ, в том числе для анализа гидрофильных соединений, может рассматриваться как эффективный только в случае изолирования метоклопрамида (26,1±0,7%).

Предложенная нами методика проведения ТФЭ наиболее эффективна и дает воспроизводимые результаты. Она позволяет обнаружить в извлечении 53,6±2,5% исходной концентрации изониазида и 72,9±1,3% метоклопрамида без какой-либо предварительной обработки раствора изониазида реагентами, что значительно сокращает время анализа.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: chuvina82@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5512-7648