Одна из основных целей химико-токсикологических исследований биологического материала человека — установление круга лиц, имеющих контакт с наркотическими средствами или психотропными веществами. В некоторых случаях подразумевается не только выявление факта использования или пассивного контакта с ними, но и выявление таких данных, как продолжительность, периодичность и интенсивность употребления [1—4]. В судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях в настоящее время расширяется список биологических объектов, которые можно взять на исследование от живого лица. Один из таких объектов — волосы. По сравнению с такими классическими биообъектами, как моча и кровь, анализ волос позволяет сделать вывод о давности и продолжительности приема наркотических средств, так как волосы во время своего роста способны накапливать токсичные вещества и поэтому являются долговременным «хранилищем» чужеродных веществ [5]. В структуре волос ксенобиотики не подвергаются метаболизму. Важным признаком волос как объекта химико-токсикологического анализа является то, что они не требуют особых условий при отборе проб, хранении и транспортировке [2, 6, 7].

Следует отметить, что пути и механизмы встраивания веществ в структуру волос до конца не изучены. В связи с этим для изолирования предлагается использовать такие методы, как экстракция органическим растворителем при нормальных и пониженных температурах; термическое разложение объектов; щелочной или кислотный гидролиз с последующей жидкость-жидкостной экстракцией (ЖЖЭ) смесью растворителей; извлечение метанолом или подкисленным метанолом в ультразвуковой бане; ферментативный гидролиз с последующей ЖЖЭ смесью растворителей.

В предыдущих работах была показана важность этапа изолирования токсиканта из биологического объекта, а именно правильный подбор условий гидролиза для более полного извлечения целевого вещества из внутренней части волоса [8—10].

Цель исследования — апробация разработанной методики изолирования с помощью ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами токсичных веществ из группы лекарственных на неокрашенных волосах (шерсть лабораторных животных) и экспертном материале.

В экспериментах использовали следующие реактивы: субстанции фенобарбитала (по ФС 42−2424−93), дифенгидрамина гидрохлорида (по ФС 42−0232−07), трилона Б (чда) и цистеина; глазные капли Мидриацил (с.а. «Алкон-Куврер» н.в., Бельгия), содержащие 10 мг тропикамида гидрохлорида в 1 мл раствора; ферменты: папаин (ЗАО «Вектон»), трипсин (ООО «Самсон-Мед»), химотрипсин (ООО «Самсон-Мед»), химопсин (ООО «Самсон-Мед»). Применяли газовый хроматограф Agilent 7890 с масс-селективным детектором A/5977 MSD на колонке HP-5MS размером 30 м×0,25 мм×0,25 мкм, программу MassHunter GC MS. Обработку полученных данных осуществляли в программах MassHunter Qualitative Analysis и MassHunter Quantitative Analysis [10].

Эксперименты проводили на лабораторных животных: морских свинках (самцы альбиносов) в возрасте около 6 мес и массой в среднем 0,650 кг, самцах морских свинок черного природного окраса в возрасте 4 мес и массой 0,450 кг, самках белых беспородных крыс в возрасте 4 мес массой 0,250 кг. Лабораторных животных содержали в экспериментально-биологической клинике (виварий), согласно требованиям международной системы правил и требований к лабораториям, которые занимаются изучением воздействия новых химических соединений на окружающую среду и здоровье человека (Good Laboratory Practice) [11—16].

Дозы лекарственных препаратов для лабораторных животных рассчитывали исходя из суточной дозы для человека: 500 мг фенобарбитала, 50 мг димедрола, 6 мг тропикамида гидрохлорида [17]. Количество вещества и объем вводимого раствора пересчитывали на массу тела каждого лабораторного животного с учетом способа введения лекарственного вещества. Морским свинкам массой 0,450—0,650 кг вводили перорально 3,3—4,5 мг фенобарбитала в 3 мл воды очищенной и 2,7—4,1 мг димедрола в 3мл воды очищенной, крысам массой 250—300 г — внутривенно 2,4 мг тропикамида гидрохлорида в 0,5—1,0 мл воды очищенной [14].

Эксперимент. Для моделирования ситуации длительного употребления лекарственных средств из группы барбитуратов и дифенгидрамина на протяжении нескольких месяцев ежедневно лабораторные животные черной и белой природной окраски перорально через зонд получали 0,1% раствор фенобарбитала и 0,1% раствор димедрола в количестве, соответствующем суточной дозе для человека в перерасчете на массу тела животного; контрольные животные — равный объем воды [9, 10]. Забор шерсти производили через каждые 28 дней, так как за этот период шерсть отрастает в достаточном количестве для последующего забора. Шерсть срезали хирургическими ножницами максимально близко к коже. Средняя масса навески шерсти морских свинок составила от 2,5 до 6,5 г. Параллельно производили отбор шерсти у контрольных животных белого и черного природного окраса. Масса навески составила около 2 г. Полученные навески шерсти отмывали от внешних загрязнений очищенной водой и метанолом, высушивали при комнатной температуре, затем измельчали в шаровой мельнице в течение 10 мин.

Кислотный гидролиз шерсти, содержащей фенобарбитал, выполняли 6 М раствором хлористоводородной кислоты при температуре 37 °C в течение 12 ч. Извлечение проводили методом прямой ЖЖЭ хлороформом порциями по 3 мл 3 раза при рН 2,0. Полученные вытяжки объединяли и выпаривали. Сухой остаток растворяли в 500 мкл комплексного растворителя и исследовали методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС).

Для навесок шерсти, содержащей дифенгидрамин, выполняли щелочной гидролиз 2 М раствором калия гидроксида при температуре 37 °C в течение 12 ч. Извлечение проводили методом прямой ЖЖЭ хлороформом порциями по 3 мл 3 раза при рН 10,0—11,0. Полученные вытяжки объединяли, выпаривали досуха и исследовали в условиях, описанных далее.

Анализ выполняли на газовом хроматографе. Ввод 1мкл пробы осуществлялся автоматически. Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 0,8 мл/мин, температура испарителя 280 °C, температура интерфейса МС детектора 290 °C, температура колонки программируемая: начальная 80 °C в течение 0,4 мин, нагревание со скоростью 50 °С/мин до 100 °C, далее 30 °С/мин до 300 °C с выдержкой при конечной температуре 5 мин. Режим сканирования: по полному ионному току (SCAN) в диапазоне m/z 40—500 а.е.м.

Полученные хроматограммы обрабатывались с помощью программ Chemstation Data Analysis, Qualitative MassHunter Analysis, AMDIS, а количество фенобарбитала и дифенгидрамина определяли методом ГХ-МС, расчет вели по градуировочным графикам. Методики валидированы [9, 10].

Шерсть контрольного животного гидролизовали по методикам, описанным для фенобарбитала и дифенгидрамина.

Затем для образцов неокрашенной шерсти (черной и белой) применяли метод ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами.

Ферменты (трипсин, химотрипсин, химопсин и папаин) малоспецифичны, т. е. расщепляют пептидные связи различных аминокислотных последовательностей и являются доступными, что актуально для дальнейшего внедрения данной методики в практику работы лабораторий. В качестве буферного раствора использовали фосфатный буферный раствор рН 7,4 для трипсина, химотрипсина и химопсина и ацетатный буферный раствор рН 4,7 для папаина. Указанные значения рН среды, согласно данным литературы [18—21], являются оптимальными для достижения максимальной активности работы фермента.

Пробы образцов шерсти в растворе фермента (соотношение фермент — субстрат 1:100) выдерживали при температуре 37 °C в течение 3 ч, затем центрифугировали и отбирали супернатант. К пробам добавляли вторую порцию раствора фермента, снова выдерживали в термостате в аналогичных условиях 3 ч. Затем пробы центрифугировали и отбирали супернатант. Общее время гидролиза составило 9 ч. Из полученных центрифугатов производили экстракцию исследуемых веществ по описанной ранее методике.

На хроматограммах исследованных проб шерсти после гидролиза 6 М раствором хлористоводородной кислоты наблюдали пики со временем удерживания 9,08 и 8,97 мин после проведения ферментативного гидролиза, что, согласно данным библиотеки, соответствует фенобарбиталу. Не наблюдали пиков основных метаболитов фенобарбитала: 5-этил-5-п-гидроксифенилбарбитуровая кислота и п-оксифенилбарбитал или продуктов разложения пиримидинового цикла.

На хроматограммах исследованных проб шерсти после гидролиза 2 М раствором калия гидроксида и ферментативного гидролиза отметили пик со временем удерживания 8,05 мин. Полученный масс-спектр совпадает с масс-спектрами библиотек и соответствует основанию димедрола — дифенгидрамину; не наблюдали пиков метаболитов (бензгидрол и N, N-диметил-2-аминоэтанол) или продуктов разложения (рис. 1).

В ходе эксперимента получили следующие данные о количественном содержании фенобарбитала и дифенгидрамина в шерсти лабораторных животных черной и белой природной окраски (табл. 1 и

Оказалось, что эффективность ферментативного гидролиза выбранных протеолитических ферментов сопоставима и позволяет повысить степень изолирования исследованных веществ в 2 раза по сравнению с кислотным и щелочным гидролизом. Предлагаемая методика может быть использована для изолирования веществ основного и кислого характера из природно неокрашенных и окрашенных в черный цвет волос.

Для определения оптимального времени гидролиза произвели отбор проб при термостатировании в течение 1 и 2 ч. Ферментативный гидролиз за 1-й и 2-й часы позволяет обнаружить в пробах определяемое вещество, однако хроматографические характеристики полученного пика неудовлетворительные. Они несимметричны, имеют низкую интенсивность, что объясняется малой концентрацией определяемого вещества в пробе (на пределе обнаружения используемого метода). Гидролиз после 3 ч позволяет получить пик определяемого вещества с удовлетворительными хроматографическими характеристиками для оценки количественного содержания вещества в пробе.

Для разработанной методики ферментативного гидролиза с помощью протеолитических ферментов определили некоторые валидационные характеристики (табл. 3)

Разработанная методика ферментативного гидролиза апробирована на шерсти лабораторных животных, получавших тропикамида гидрохлорид, и на экспертных образцах волос человека.

В течение 1мес белым крысам-самкам внутривенно вводили тропикамида гидрохлорид в суточной дозе для человека, пересчитанной на массу тела животного. По истечении 28 дней произвели отбор проб шерсти по методике, описанной ранее.

Пробоподготовку шерсти производили по предлагаемой методике ферментативного гидролиза с использованием следующих протеолитических ферментов: трипсин, химотрипсин, химопсин и папаин. Экстракцию выполняли из среды рН 8,0—9,0. Параллельно проводили щелочной гидролиз по методике, описанной ранее для димедрола.

Методика изолирования и условия хроматографирования для основания тропикамида аналогичны для фенобарбитала и дифенгидрамина.

На хроматограммах исследованных проб шерсти после гидролиза 2 М раствором калия гидроксида и ферментативного гидролиза с использованием протеолитических ферментов наблюдали пик со временем удерживания 12,25 мин. На масс-спектре отмечали базовые и осколочные ионы с m/z 92 (100), 254 и 91, что совпадает с библиотечными спектрами и соответствует основанию тропикамида. Не отметили пиков метаболитов или продуктов разложения (рис. 2).

Количественное содержание основания тропикамида определяли после ферментативного гидролиза за 3 и 6 ч. На хроматограммах после ферментативного гидролиза за последние 3 из 9 ч гидролиза пики основания тропикамида обнаружили на уровне базовой линии (на уровне шума), что не позволило выполнить количественную оценку тропикамида в пробах.

Полученные результаты показали, что содержание основания тропикамида в извлечениях после щелочного гидролиза составило 13,29±9,49 нг/мг, после ферментативного — 14,50±2,32 нг/мг. Это позволяет сделать следующее заключение: ферментативный гидролиз увеличивает степень извлечения тропикамида на 18% по сравнению с щелочным гидролизом; пик определяемого вещества на хроматограммах после ферментативного гидролиза по сравнению с пиком данного вещества после щелочного гидролиза имеет удовлетворительные характеристики (пик основания тропикамида симметричен, обладает достаточной интенсивностью для проведения количественного определения в пробе); спектрограммы высокого качества и не требуют дополнительного вычитания фона для проведения идентификации.

Образцы волос человека (экспертный материал) собирали согласно рекомендациям по отбору проб (Приказ МЗ РФ № 40 от 27.01.16) [24]. На стадии пробоподготовки использовали разработанный метод ферментативного гидролиза для выделения веществ из структуры волос. Условия проведения гидролиза, подготовки проб к хроматографированию и условия хроматографирования описаны ранее.

Исследовали 78 проб волос, из них 6 показали положительный результат. Обнаружили следующие сильнодействующие, наркотические и психотропные вещества: метамфетамин, метилэкгонин, кокаин, амфетамин, форметорекс, пировалерон.

В остальных пробах были идентифицированы пики никотина и кофеина, а также лекарственных веществ хлорфенезина, доксиламина, фенирамина (рис. 3).

1. Разработанный метод ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами может быть использован для разрушения связи токсичных веществ различной химической природы с белками волос. Он позволяет увеличить степень экстракции фенобарбитала в извлечениях в 2 раза по сравнению с кислотным гидролизом, дифенгидрамина — в 3 раза по сравнению с щелочным гидролизом.

2. Ферментативный гидролиз проводят в более мягких условиях (при рН 4,5—7,4 от 3 до 6 ч) по сравнению с кислотным (при рН 1,0—2,0 12 ч) и щелочным (при рН 11,0—12,0 12 ч) гидролизом, поэтому его можно использовать для изолирования легко разрушаемых токсичных веществ при воздействии агрессивной рН и длительного времени экспозиции в условиях кислотно-основного гидролиза.

3. Ферментативный гидролиз занимает меньше времени (3—6 ч) по сравнению с кислотным и щелочным гидролизом (12—14 ч). Проведение гидролиза с использованием изученных протеолитических ферментов через 1 ч дает результаты, позволяющие провести идентификацию веществ с высокой степенью вероятности совпадения полученных спектров с данными библиотек. Для количественной оценки содержания веществ в извлечениях минимальное время ферментативного гидролиза составляет 3 ч. При гидролизе в течение 6 ч возможно извлечь максимальное количество токсиканта.

4. Разработанная методика ферментативного гидролиза показала одинаковую эффективность на неокрашенной (черная и белая) шерсти лабораторных животных, что позволяет рекомендовать данную методику для проведения гидролиза волос светлой и темной природной окраски.

5. Для разработанных методик гидролиза протеолитическими ферментами определены валидационные характеристики: сходимость, внутрилабораторная воспроизводимость, линейность, устойчивость.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2e-mail: ulia.slustovskaya@pharminnotech.com;
https://orcid.org/0000-0002-4856-2745