До настоящего времени пато- и танатогенез алкогольных интоксикаций недостаточно изучен. Существующая их трактовка признается несовершенной, требующей всестороннего и углубленного анализа. Поиск и разработка надежных диагностических маркеров для оценки роли алкогольных интоксикаций в генезе смертельного исхода остается актуальной проблемой судебно-медицинской практики [1—3].

Патоморфологические изменения в головном мозге, сердце, почках, надпочечниках, поджелудочной железе, сосудах и нервах при острой и хронической алкогольной интоксикации широко представлены в многочисленных публикациях [4—6]. Хорошо известно, что печень играет ключевую роль в метаболизме экзогенного этанола, одновременно являясь основной мишенью для его токсического действия [7]. Вместе с тем детальное изучение печени в этом направлении не проводилось.

Цель исследования — поиск дополнительных диагностических маркеров, характеризующих функциональное состояние печени для обоснования причины смерти от отравления этанолом.

Исследование ферментов в органах и тканях трупа затруднено в связи с аутолизом и блокадой энзиматических реакций, обусловленной острым кислородным голоданием при наступлении смерти [8]. Вместе с тем при воспроизведении оживления трансплантируемых органов и тканей показано, что характер деструкции внутриклеточных ферментов качественно различается в период жизни и после наступления смерти. Так, в живом организме наблюдается быстрый внутриклеточный распад ферментов, а после смерти в результате остро развившегося кислородного голодания в клетках происходит блокада энергетических и пластических процессов без разрушения белковых структур [9]. Сохранность клеток и их внутриклеточных структур после наступления смерти зависит от степени выраженности аутолиза. В связи с этим поиск способов его замедления является перспективным направлением при изучении ферментов в постмортальном периоде. Если после смерти труп находился при пониженной температуре, структурная организация клеток остается сохранной в течение относительно продолжительного времени [10, 11].

Главный признак сохранности структуры клетки — целостность ее ядра. При создании специальных условий инкубации с определенным режимом температуры, pH среды, точных концентраций субстратов, коферментов, рабочих растворов ферментативную активность в тканях и органах трупа можно определить гистохимическими методами. Так, А.В. Капустин и соавт. [12] определяли ферментативную активность в органах трупа в зависимости от продолжительности посмертного периода. Оказалось, что через 13—24 ч после наступления смерти в миокарде выявлялась ферментативная активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД), гексокиназы, неспецифических эстераз. Авторы отметили, что снижение активности указанных ферментов в течение второй половины первых суток после смерти не достигало статистически значимых величин. О сохранении ферментативной активности в тканях и органах человека в течение 2—3 дней после его смерти сообщается в работах других авторов [13, 14]. Аналогичные данные по определению ферментативной активности в посмертном секционном материале с помощью гистохимических методов имеются в работах зарубежных авторов [15, 16].

Исследовали 110 случаев смерти: 95 с диагнозом «острое отравление этанолом при алкоголемии в диапазоне 3,0—3,7‰» (основная группа) и 15, в которых причиной смерти явилась тяжелая черепно-мозговая травма (контрольная группа). В контрольной группе у погибших экзогенный алкоголь в крови отсутствовал. Возраст умерших составил 25—60 лет, преобладали мужчины (79%). От наступления смерти до помещения трупов в холодильную камеру морга с температурой 3—5 ^оС прошло 2—6 ч. Гистохимические исследования проводили через 12—18 ч после судебно-медицинского исследования трупов. По времени наступления смерти контрольная и основная группы были сопоставимы, давность наступления смерти 18—24 ч.

Во всех наблюдениях определяли активность алкогольокисляющих ферментных систем (АОФС) в 4 периферических и 4 центральных участках печени. После вскрытия из кусочков печени изготавливали срезы на микротоме-криостате, предварительно заморозив материал в ацетоне, охлажденном жидким азотом. Активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) и никотинамиддинуклеотидфосфат диафоразы (НАДФ-Д) — маркерного фермента микросомальной этанолокисляющей системы устанавливали гистохимическим методом Pears в модификации Т.П. Перовой [17]. Для выявления активности каталазы-пероксидазы (КТ-ПО) использовали ортодианизидиновый метод. При инкубации в присутствии кофермента НАДН субстрат окислялся солями дитетразолия с образованием формазана фиолетово-синего цвета. Красители инкубационных сред готовили в день исследования в соответствии с прописями из руководства Р. Лилли [18]. В каждой серии исследований осуществляли контроль специфичности ферментативных реакций инактивацией ферментов высокой температурой (800 °С в течение 1 ч) и удалением субстрата из инкубационной среды. При наличии ферментативной активности печеночной паренхимы в рабочих опытах в контрольной группе наблюдали отрицательные реакции. Измерения показателей производили на оптическом микроскопе (cellSens, Олимп) с использованием метода количественной морфометрии для компьютерной программы Morfolog [7, 19]. В гистопрепаратах отсутствовали выраженные явления аутолиза [20], полученные изменения не являлись артефактами [21].

В зависимости от преобладания в гистологических препаратах признаков хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) в виде стеатоза, цирроза, гепатита, рассчитанных с помощью индекса Knodell, все наблюдения разделили на группы: АГП (адаптивная гепатопатия), АС (алкогольный стеатоз), АГ (алкогольный гепатит) и АЦ (алкогольный цирроз). Согласно концепции метаболического зонирования печени [22], ферментативную активность АОФС изучали раздельно в каждой из структурно-функциональных зон ацинусов печени: портальных трактах (зона 1); печеночных балках (зона 2) и области центральных вен (зона 3). Сравнивали в группах наблюдений значения активности ферментов в печеночных ацинусах. Дополнительно устанавливали ранговую последовательность АГП, АС, АГ и АЦ по активности АДГ. Статистический анализ с вычислением средней арифметической и ее ошибки выполняли с помощью статистического приложения программы Excel (Microsoft Office-2007) и программного пакета Statistica v. 6.

Провели дискриминантный анализ и установили статистически значимые (р<0,05) показатели ферментативной активности АОФС при отравлении этанолом.

В контрольной группе АДГ выявили во всех структурно-функциональных зонах печеночных ацинусов с некоторым снижением активности в центральных участках печени. На протяжении от зоны 1 к зоне 2 печеночных ацинусов ферментативная активность АДГ и КТ-ПО уменьшалась, причем более значительные различия наблюдали в участках печени из периферических ее отделов. Активность НАДФ-Д составила от 0,481±0,02 до 0,674±0,01 усл. ед.

В группах наблюдений АГП, АГ и АЦ выявили индукцию активности АДГ, наиболее выраженную в зоне портальных трактов. Наоборот, в группе АС установили снижение активности АДГ до 0,36±0,03 усл. ед. (рис. 1).

Повышенную активность АДГ от 0,48±0,01 до 0,57±0,02 усл. ед. определили в группе АГП. В группе АГ увеличение активности АДГ имело умеренный характер. Максимальная индукция АДГ установлена в группе АЦ (см. таблицу).

При отравлении этанолом в структурных зонах ацинусов центральных участков печени изменялась ферментативная активность НАДФ-Д (рис. 2).

Установили также выраженную индукцию КТ-ПО с наибольшим включением зоны 3 ацинусов. Угнетение специфического ответа НАДФ-Д зарегистрировали в группах АС и А.Г. При сравнении групп АГП, АС, АГ и АЦ между собой по показателям активности АДГ получили результаты, позволяющие расположить группы в порядке убывания активности АДГ: АЦ, АГ, АС, АГП.

В случаях отравления этанолом в организме умерших обнаруживают избыточные количества экзогенного этилового спирта, а в гистопрепаратах печени — совокупность патоморфологических изменений, патогномоничных частоте, продолжительности и тяжести предшествовавших алкогольных эксцессов. Сами по себе эти данные не обеспечивают достаточно надежного обоснования генеза смерти от алкогольной интоксикации. Гистохимические методы позволяют дополнить комплекс морфологических данных сведениями об АОФС, осуществляющих окисление экзогенного этанола на момент наступления смерти, расширяя наши представления о механизмах танатогенеза и возможности судебно-медицинской диагностики причин смерти [23—26].

С помощью теории зонирования печеночного ацинуса можно провести структурно-функциональный анализ изменений в печени при алкогольной интоксикации. Количественные показатели ферментативной активности АДГ, НАДФ-Д и КТ-ПО на протяжении портальных трактов, печеночных балок и области центральных вен печеночных ацинусов позволяют установить их роль в детоксикации этанола в конкретных структурах печени. При комплексном изучении отравлений этанолом с использованием гистохимических методов определения АОФС можно судить не только о морфологических изменениях, но и о метаболической составляющей нарушений в печени [27].

Увеличение АДГ в печеночных ацинусах умерших от отравления этанолом, установленное в АГП-группе наблюдений относительно контрольных значений, может быть связано с приспособительной реакцией в ответ на токсическую экзогенную алкоголемию. Максимально высокая активность АДГ, установленная при АЦ, объясняется, по-видимому, компенсаторной индукцией фермента в регенерированных гепатоцитах.

При АС в 3-й зоне печеночного ацинуса установлено уменьшение АДГ до 0,36±0,03 усл. ед. при одновременном повышении АДГ в 1-й и 2-й зонах, что можно трактовать как результат морфофункциональной перестройки с нарушениями кровообращения в печеночном ацинусе при А.С. Сочетание этих показателей может быть использовано в качестве диагностических маркеров отравления этанолом.

При отравлении этанолом в группах АГ и АЦ наиболее высокие значения АДГ наблюдали в зоне 1, а НАДФ-Д и КТ-ПО – в области центральных вен печеночных долек (зона 3). Оказалось, что НАДФ-Д и КТ-ПО, которые при низких концентрациях экзогенного этанола незначительно влияют на его окисление, при высокой экзогенной алкоголемии проявляют выраженную индукцию ферментативной активности, пропорциональную уровню алкоголемии, особенно КТ-ПО.

В окислении экзогенного этанола ведущую роль играет АДГ. По ее показателям в печени и с учетом выделенных групп наблюдений выясняли генез смерти от отравления этанолом. Исследуемые группы сравнивали между собой по преобладающей величине ферментативной активности АДГ в гепатоцитах. В верхней части установленной таким образом ранговой последовательности оказалась группа АГП, в которой при отсутствии деструктивных нарушений в печени диагноз «отравление этанолом» как причина смерти выглядел более убедительным, чем в группах АС, АГ и АЦ с разной степенью выраженности морфологических проявлений ХАИ.

Таким образом, только уровень экзогенной алкоголемии не может обеспечить достаточно надежное обоснование причины смерти от отравления этанолом, а характерные для острого отравления этанолом морфологические изменения в органах и тканях при этом отсутствуют. В основе судебно-медицинской диагностики отравлений этанолом должна лежать комплексная оценка совокупности патоморфологических, судебно-химических и гистохимических данных.

Дополнительными маркерами причины смерти от отравления этиловым спиртом являются следующие:

— индукция АДГ, более выраженная в гепатоцитах портальных трактов при АГП;

— ингибирование АДГ при АС, достигающее 0,36±0,03 усл. ед. в области центральных вен, при одновременном увеличении ферментативной активности АДГ в зонах 1 и 2 печеночных ацинусов;

— увеличение активности НАДФ-Д и КТ-ПО, пропорциональное уровню алкоголемии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: mrzv66@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0594-257X