ВИЧ-инфекция — одна из самых сложных медико-биологических проблем современного здравоохранения. Антиретровирусная терапия способна снизить размножение вируса и позволяет контролировать прогрессирование болезни, что является благоприятным прогнозом для жизни больного [1]. Практически во все схемы лечения больных с ВИЧ-инфекцией входит ламивудин, относящийся к группе ингибиторов обратной транскриптазы [2]. Лечение таких пациентов — это пожизненный процесс, который заключается в комплексном подходе к использованию препаратов различных фармакологических групп [3].

Известны случаи острых и смертельных отравлений ламивудином, а также его комбинациями с антидепрессантами, нейролептиками, обезболивающими и другими лекарственными средствами (мебикар, клозапин, метамизол натрия, амитриптилин, галоперидол, имипразин, перициазин, фенобарбитал, флуоксетин, хлорпротиксен) [4].

При фармацевтическом анализе ламивудина в субстанции и лекарственной форме (таблетки) применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии — ВЭЖХ (ФС 000468−291212, ФСП 002393−050314). Химико-токсикологический анализ ламивудина, а также его комбинаций с другими лекарственными средствами не нашел отражения в литературе.

Цель исследования — разработать методику обнаружения ламивудина в биологических объектах, его изолирования и количественного определения.

Использовали оборудование: спектрофотометр СФ-2000 (РФ), жидкостной хроматограф Милихром А-02 с УФ-детектором (РФ), установку для твердофазной экстракции Waters и патроны для твердофазной экстракции марки Oasis HLB.

В ходе эксперимента использовали таблетки ламивудина по 0,15 г (АО «Фармасинтез», Россия), 70% этиловый спирт, органические растворители: хлороформ, дихлорметан, эфир, этилацетат, бензол, изопропанол, гексан; растворы электролитов: 20% раствор NaCl, насыщенный раствор NaCl, 5% раствор Na₂SO₄, насыщенный раствор Na₂SO₄, 20% раствор (NH₄)₂SO₄ и насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄.

Ламивудин изолировали методами экстракции — жидкость-жидкостной (ЖЖЭ) и твердофазной (ТФЭ).

Жидкость-жидкостная экстракция: навеску препарата 0,05 г растворяли в 1 мл воды, добавляли 70% спирт (1 мл), доводили значение рН от 2,0 до 11,0 с помощью 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и 25% концентрированного раствора аммиака. Затем экстрагировали органическим растворителем. Оставляли при комнатной температуре до полного удаления органического растворителя.

Твердофазная экстракция: использовали систему с вакуумной камерой Waters, насосом высокого давления CAST, патроном Oasis HLB. Кондиционирование сорбента заключалось в последовательном промывании его 3 мл метанола и 3 мл фосфатного буфера рН 6,0. Образец загружали в патрон и последовательно промывали подкисленной водой и гексаном. Далее патрон просушивали под вакуумом в течение 20 мин и элюировали. Элюент 1 — гексан-этилацетат (1:1); элюент 2 — дихлорметан-изопропиловый спирт — 25% концентрированный раствор аммиака (72:20:2). Полученные элюаты оставляли при комнатной температуре до полного испарения органических растворителей.

Для обнаружения ламивудина в извлечениях использовали хроматографию в тонком слое сорбента (ТСХ), УФ-спектрофотометрию и ВЭЖХ.

Обнаружение ламивудина в извлечениях методом ТСХ: на линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил» микропипеткой наносили по 0,4 мл извлечений ламивудина. Пластинку высушивали и хроматографировали в системе этилацетат-трихлорметан — 25% концентрированный раствор аммиака (17:4:1) восходящим методом. После прохождения фронта растворителя пластинку вынимали из камеры, сушили при комнатной температуре в течение 20 мин, детектировали пятна в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Обнаружение ламивудина в извлечениях методом УФ-спектрофотометрии [5]: к сухому остатку добавляли 10 мл воды, 1 мл раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до метки. Регистрировали спектр поглощения раствора ламивудина на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм в области длин волн 220—400 нм.

Обнаружение и количественное определение ламивудина в извлечениях методом ВЭЖХ [6]: использовали колонку с обращенно-фазовым сорбентом ProntoSIL-120−5 C18 AQ. Подвижная фаза: элюент 1—4 M раствор лития перхлората — 0,1 M раствор хлористоводородной кислоты (5:95); элюент 2 — ацетонитрил. Условия проведения анализа: линейный градиент растворителя 2000 мкл от 5 до 100%, скорость потока 150 мкл/мин, температура колонки 35 ˚C, объем пробы 2 мкл, длина волны 280 нм. Количественное содержание ламивудина в извлечениях рассчитывали по стандартному образцу.

Статистическую обработку результатов анализа проводили по методике, изложенной в ГФ XIII.

Для разработки оптимальной методики изолирования ламивудина из биологических объектов методом ЖЖЭ экспериментально подбирали органический растворитель, значение рН среды, электролит, оказывающий высаливающее действие, время и кратность экстракции [7, 8].

Ламивудин максимально изолируется из водных растворов этилацетатом при рН 10,0 (рис. 1).

Изучение влияния электролитов на степень экстракции ламивудина показало, что наибольшее высаливающее действие оказывает 20% раствор аммония сульфата. В его присутствии экстракция повысилась до 79,5±2,4%. Увеличение времени экстракции до 7 мин привело к изменению степени экстракции ламивудина до 81,3±2,9%. Использование трехкратной экстракции позволило увеличить экстракцию ламивудина до 85,7±3,3%.

Полученные данные применили для разработки методики изолирования ламивудина из биологических объектов: моча, слюна и печень.

Методика изолирования ламивудина из модельной смеси мочи: навески ламивудина 0,3; 0,6 и 0,9 г растворяли в 15 мл воды, вносили в 35 мл мочи и оставляли при комнатной температуре на 24 ч. Модельную смесь фильтровали. Затем 1 мл фильтрата переносили в пробирку, доводили рН до 10,0 и добавляли 1 мл 20% раствора аммония сульфата, после этого экстрагировали этилацетатом трехкратно в течение 7 мин.

Методика изолирования ламивудина из модельной смеси слюны: 20 мл слюны замораживали на 24 ч для снижения активности ферментов, затем размораживали, смешивали с раствором ламивудина в 3 концентрациях и оставляли на 24 ч. В модельный образец слюны добавляли 1 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков. Центрифугировали. Затем 1 мл центрифугата переносили в пробирку, доводили рН до 10,0 и добавляли 1 мл 20% раствора аммония сульфата, после этого экстрагировали этил-ацетатом трехкратно в течение 7 мин.

Методика приготовления модельных проб печени: к 25 г измельченной трупной печени добавляли раствор ламивудина (0,3, 0,6 и 0,9 г, растворенные в 15 мл воды), перемешивали. Приготовленные образцы оставляли на сутки при комнатной температуре.

Изолирование ламивудина из модельных образцов трупной печени проводили по методам Васильевой, Крамаренко и Стаса-Отто [9]. Экстракцию ламивудина из центрифугатов осуществляли этилацетатом при рН 10,0 в присутствии электролита — 20% раствора аммония сульфата трехкратно в течение 7 мин.

Ламивудин после изолирования из модельных образцов идентифицировали методами ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.

Значение Rf пятна извлечения ламивудина из биологического материала соответствовало значению Rf стандартного образца свидетеля ламивудина (0,31±0,02).

УФ-спектр стандартного образца ламивудина в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты характеризуется максимумом поглощения при длине волны 279±1 нм (рис. 2),

При обнаружении ламивудина методом ВЭЖХ на хроматограмме стандартного образца наблюдали один пик с временем удерживания 4,6 мин (рис. 3),

Степень экстракции ламивудина из мочи, слюны и печени оценивали методом ВЭЖХ. Статистически обработанные результаты представлены в табл. 1 и 2.

Таким образом, с помощью разработанной методики из мочи, слюны и печени изолируется достаточное количество ламивудина для установления факта отравления. Следует отметить, что получены сопоставимые результаты при изолировании ламивудина из модельных образцов печени по методам Васильевой, Крамаренко и Стаса-Отто [9].

Степень экстракции из модельных образцов мочи, слюны и печени методом ТФЭ составила 89,3±1,5; 91,4±1,8 и 90,8±2,3% соответственно.

Валидационная оценка разработанной методики показала пригодность ее для химико-токсикологического анализа. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышало 4,8% (ЖЖЭ) и 1,6% (ТФЭ) для мочи; 3,1% (ЖЖЭ) и 2,7% (ТФЭ) для слюны; 4,4% (ЖЖЭ) и 1,9% (ТФЭ) для печени. Следовательно, для изолирования ламивудина из мочи, слюны и печени можно использовать как ЖЖЭ, так и ТФЭ.

1. Разработаны методики идентификации и количественного определения ламивудина в извлечениях из мочи, слюны и печени методами ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.

2. Подобраны условия изолирования ламивудина: экстрагент — этилацетат; рН 10,0; электролит — 20% раствор аммония сульфата, время — 7 мин; трехкратная экстракция; метод — ЖЖЭ.

3. Разработаны методики изолирования ламивудина из биологических объектов: мочи, слюны и печени с использованием ЖЖЭ (80,0±8,1; 76,2±10,3 и 74,8±8,7% соответственно) и ТФЭ (89,3±1,5; 91,4±1,8 и 90,8±2,3% соответственно). Валидационная оценка разработанных методик свидетельствует о пригодности предложенных методик для изолирования ламивудина из мочи, слюны и печени. Относительное стандартное отклонение при оценке сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости не превышала 4,8% (ЖЖЭ) и 1,6% (ТФЭ) для мочи; 3,1% (ЖЖЭ) и 2,7% (ТФЭ) для слюны; 4,4% (ЖЖЭ) и 1,9% (ТФЭ) для печени.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.