Фелодипин [3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропиридина-3,5-дикарбо-ксилат (IUPAC); 4-(2,3-дихлорфенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты этилметиловый эфир; (±)-этилметил-4-(2,3-дихлорофенил)-1,4-дигидро-2,6-диметил-3,5-пиридиндикарбоксилат; 3-этид-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидро-3,5-пиридиндикарбоксилат] наряду с амлодипином, исрадипином и нифедипином относится к дигидропиридиновой группе блокаторов кальциевых каналов второго поколения и назначается в основном для лечения гипертонии.

Фелодипин, как и другие блокаторы кальциевых каналов, действует, блокируя приток ионов кальция в гладкие мышцы сосудов и клетки сердечной мышцы во время деполяризации, что приводит к артериальной вазодилатации и уменьшению сердечной деятельности и потребления кислорода [1—3].

Фелодипин представляет собой светло-желтый кристаллический порошок; температура плавления 145 °C [1], 201 ° по другим источникам 142—145 °С [4]; нерастворим в воде (19,7 мг/л), хорошо растворим в дихлорметане и этаноле. Определена возможность растворения данного аналита в жидком и сверхкритическом диоксиде углерода при различных температуре и давлении [1, 2, 5]; log P (октанол—вода) фелодипина 3,86 [2]. Определенная спектрофотометрическим методом рК_а фелодипина составляет 5,07 [6].

Фелодипин и ряд других блокаторов кальциевых каналов токсичны для теплокровных и могут являться причиной отравлений различной степени тяжести [7—9].

Описаны случаи летальных отравлений людей фелодипином [7, 10, 11]. LD₅₀ для мышей при пероральном введении 250 мг/кг, внутривенном — 3,1 мг/кг, внутрибрюшинном — 76 мг/кг, подкожном — 205 мг/кг; для крыс при пероральном введении — 1050 мг/кг, внутривенном — 5,4 мг/кг, внутрибрюшинном — 23 мг/кг, при подкожном — более 600 мг/кг; для собак при пероральном введении — 200 мг/кг [2].

Основным метаболитом фелодипина считают дегидрофелодипин [1]. Изолирование фелодипина из плазмы крови человека можно проводить смесью диэтиловый эфир-гексан (1:1 по объему). В извлечении вещество определяют методом ЖХ-МС/МС, используя колонку Hypersil BOS-C18 (150 мм × 2,1 мм; 5 мкм); элюент — ацетонитрил 0,1% раствор муравьиной кислоты (12:88 по объему); принцип распылительной ионизации [12].

Для определения фелодипина в плазме крови применяют ВЭЖХ в колонке с привитой фазой С-18 при элюировании мицеллярной подвижной фазой (рН 7,0), состоящей из 85 мМ натрия додецилсульфата, 25 мМ фосфатного буфера и 6,5% пентанола, и флуориметрическом детектировании [13].

Описана возможность извлечения фелодипина из плазмы крови человека смесью диэтилового эфира и гексана (80:20 по объему) для дальнейшего определения аналита методом ВЭЖХ с детектором МС/МС [14].

Известна методика выделения соединения из плазмы собаки путем обработки биожидкости метанолом, очистки на предколонке и последующего определения методом ЖХ-МС/МС в колонке ZORBAX SB-C₁₈ [15].

В качестве изолирующих агентов для извлечения блокаторов кальциевых каналов производных 1,4-дигидропиридина, к которым относится и фелодипин, из крови и тканей трупных органов используют хлороформ и ацетон [16, 17].

Активное применение фелодипина в отечественной и зарубежной медицине, наличие у него токсических свойств, случаи летальных исходов при отравлениях этим соединением определяют его важное судебно-химическое значение.

В химико-токсикологическом отношении фелодипин до настоящего времени изучен недостаточно. Например, неясен характер распределения вещества в организмах теплокровных.

Цель исследования — изучение распределения фелодипина у теплокровных (крысы).

Объект исследования — фелодипин [3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорофенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропиридина-3,5-дикарбоксилат; ФСП 42−9597−08]. Под-опытные животные — лабораторные крысы линии Wistar.

Исследования проводили на пяти экспериментальных группах животных и одной контрольной. Каждая группа состояла из 5 половозрелых особей мужского пола 4-месячного возраста массой 305—315 г. Животным экспериментальных групп в просвет желудка посредством зонда (внутренний диаметр 1 мм) однократно вводили летальную дозу фелодипина (1,05 г/кг), предварительно суспендированного в воде. Когда животные погибали, их трупы вскрывали, одинаковые органы и кровь от особей каждой группы объединяли. Органы измельчали до фрагментов размером 2—4 мм, перемешивали, затем в них и в крови проводили определение фелодипина.

Подобным образом поступали с органами и кровью контрольных животных, в желудок которых предварительно вводили дистиллированную воду [17, 18].

Для извлечения фелодипина из биоматериала применяли вариант настаивания с ацетоном, ранее показавшим хорошие результаты изолирования других производных 1,4-дигидропиридина. Извлеченный фелодипин очищали в макроколонке сорбента с привитой фазой при элюировании полярной подвижной фазой.

Предварительную идентификацию проводили методом ТСХ на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ.

Один из вариантов подтверждающей идентификации — электронная спектрофотометрия (спектрофотометр СФ-2000, растворяющая среда — этанол, длина волны 200—380 нм, l=1 см). Метод использовали и для количественной оценки содержания фелодипина.

Дополнительный метод подтверждающей идентификации — ГХ-МС (хроматограф Agilent Technologies 6890 Network GC System с МС-детектором 5973 Network; режим фрагментации молекул — электронный удар энергией 70 эВ; регистрация сигнала по полному ионному току; сканирование в диапазоне 40—550 m/z).

Условия изолирования состояли в том, что определенное количество подвергнутых измельчению тканей органов погибших животных или их крови настаивали дважды по 30 мин с ацетоном, количество которого каждый раз в 2 раза превышало по массе количество биоматериала. Затем оба извлечения объединяли в чашке для выпаривания, помещали чашку в ток воздуха комнатной температуры (от 18 до 22 °С) и испаряли растворяющую среду до сухого остатка.

Оптимальные условия очистки фелодипина: макроколонка сорбента Силасорб С-18 30 мкм высотой 150 мм и диаметром 10 мм, элюирование вещества полярным элюентом ацетонитрил-вода (7:3) (значение полярности Р^׳=7,12).

Процесс очистки: сухой остаток в выпарительной чашке, оставшийся после изолирования, обрабатывали 2,0—2,5 мл смеси ацетонитрил—вода (7:3). Раствор вносили в макроколонку и проводили вымывание (элюирование) фелодипина.

Фракции элюата, по 2 мл каждая, собирали в отдельные градуированные пробирки. Присутствие фелодипина во фракциях определяли методом ТСХ [пластины Сорб-фил ПТСХ-АФ-А-УФ, подвижная фаза гексан-ацетон (7:3), наносимый объем 5—10 мкл, способ детектирования — облучение УФ-светом при длине волны 254 нм].

Обнаружение на хроматограмме пятен с Rf 0,45±0,03 позволяло судить о присутствии фелодипина в исследованных фракциях элюата.

Фракции элюата с 9-й по 11-ю (17—22 мл), в которых обнаруживали фелодипин, вносили в выпарительную чашку и испаряли растворитель. Остаток обрабатывали 5 мл этанола, получая таким образом исходный раствор.

Порции исходного раствора по 0,5—2,5 мл помещали в две выпарительные чашки (№ 1 и № 2), испаряли растворитель в токе воздуха комнатной температуры (18—22 °С) и получали два сухих остатка.

Для идентификация методом ТСХ предложено элюирование среднеполярной (значение полярности Р^׳=2,23) смесью гексан-ацетон (7:3). В процессе определения сухой остаток в чашке № 1 обрабатывали 3—4 раза незначительными (0,1—0,2 мл) порциями этанола, количественно перенося образующийся раствор на линию старта хроматографической пластины в форме полосы. На стартовую линию также наносили 0,2% этанольный раствор фелодипина-стандарта (в одну точку) в объеме 0,005—0,010 мл. После облучения высушенных от остатков подвижной фазы хроматографических пластин УФ-светом (длина волны 254 нм) проявляющийся фелодипин (пятна темного цвета) идентифицировали по величине Rf (0,45±0,03), соответствующей величине Rf вещества-стандарта. Далее фелодипин извлекали из сорбента гидрофильным элюентом, идентифицировали и количественно определяли методом электронной спектрофотометрии.

Идентичность изолированного вещества фелодипину подтверждали методом УФ-спектрофотометрии: вырезанный участок хроматограммы с пятном вещества погружали на 15 мин в заданный объем (5 или 10 мл) этанола, находящийся в пробирке, элюируя аналит при эпизодическом встряхивании пробирки.

Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение. При сравнении спектральных кривых извлеченного из биоматериала и прошедшего очистку вещества со спектром фелодипина-стандарта в этаноле обнаружили совпадение спектральных кривых по форме и положению точек экстремумов (рис. 1).

В процессе исследования выявили отсутствие фелодипина в органах и крови, взятых от животных контрольной серии. Измеренное при длине волны 363 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм не превышало 0,17 ед. опт.пл. для извлечений из органов и 0,15 ед. опт.пл. из крови (обусловлено присутствием соэкстрактивных веществ из 0,5 г биоматрицы в 1 мл фотометрируемого раствора).

Для идентификации исследуемого вещества методом ГХ-МС выбрали колонку DB-1MS (30 м × 0,25 мм, толщина слоя неподвижной фазы — диметилполисилоксана — 0,25 мкм). Условия: температура инжектора 280 °C, интерфейс детектора — 300 °C. Колонку нагревали от начальной температуры 80 °C (выдержка 2 мин) со скоростью 40 °C/мин до конечной температуры 250 °C, которую удерживали 6 мин; газ-носитель — гелий, подаваемый с линейной скоростью 0,39 м/с. В процессе идентификации сухой остаток в чашке № 2 обрабатывали 2 мл дихлорметана и вводили 4 мкл дихлорметанового раствора в хроматограф без деления потока (задержка 0,05 ч).

На рис. 2, 3 изображены хроматограммы и масс-спектры фелодипина-стандарта, а также вещества, выделенного из различных органов отравленных животных.

Оценка результатов идентификации методом ГХ-МС позволяет сделать вывод, что время удерживания изолированного из биоматериала фелодипина и его стандарта практически совпадает и составляет 9,32—9,60 мин.

На хроматограммах анализируемого соединения в области значений времени удерживания 8,5—10,5 мин не обнаруживалось (по сравнению с хроматограммой вещества-стандарта) дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

В масс-спектрах вещества, извлеченного из биоматериала, присутствовали сигналы характерных для структуры фелодипина положительно заряженных частиц с массами 42, 67, 106, 150, 178, 210, 238, 280, 310, 338, 354, 383 m/z. Среди них основной ион — 238 m/z, молекулярный — 338 m/z.

По оптической плотности этанольного элюата при длине волны 363 нм определяли количество фелодипина спектрофотометрическим методом.

Разработанные и валидированные методики количественного определения фелодипина в биоматериале на основе УФ-спектрофотометрии удовлетворяли критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности [19, 20].

Пределы обнаружения (ПО) фелодипина в твердых матрицах и крови составили соответственно 3 и 2 мкг/г, пределы количественного определения (ПКО) — 6 и 4 мкг/г соответственно.

Количественная оценка присутствия данного соеди-нения в организме отравленных животных представлена в таблице.

Как показали результаты исследования, фелодипин обнаруживается в неизменном виде как в органах, так и в крови подопытных крыс. Наибольшее количество фелодипина (в 100 г биоматериала) оказалось в тканях желудка (312,303±25,980 мг), тонкой кишке с содержимым (93,235±12,310 мг), содержимом желудка (80,072±8,510 мг), селезенке (26,083±1,758 мг) и сердце (22,259±1,588 мг), несколько меньшее — в почках (19,245±1,783 мг), мышцах (16,076±0,902 мг), печени (11,527±0,987 мг), легких (9,400±1,146 мг) и крови (6,558±0,512 мг) отравленных животных.

1. Изучили характер локализации фелодипина в организме теплокровных (крысы) после однократного внутрижелудочного введения LD₅₀ отравляющего вещества в форме водной суспензии.

2. Как изолирующий агент рассмотрен ацетон. Оптимальными для изолирования фелодипина из биоматериала явились настаивание с ацетоном (два раза по 30 мин) и минимальное массовое отношение ацетон-биоматериал 2:1.

3. Эффективность очистки аналита достигнута в колонке сорбента Силасорб С-18. Идентификацию фелодипина проводили методами ТСХ, спектрофотометрии и ГХ-МС. Для количественного определения предложены спектрофотометрические методики, валидированные по ряду параметров.

4. Наибольшее количество фелодипина обнаружили в тканях желудка (312,303±25,980 мг/100 г), тонкой кишке и ее содержимом (93,235±12,310 мг/100 г), содержимом желудка (80,072±8,510 мг/100 г) и селезенке (26,083±1,758 мг/100 г).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.